肠球菌心内膜炎动物模型建立及粪肠球菌心内膜炎抗原的原核表达、纯化

发布时间：2020-03-15 03:58

【摘要】： 目的:临床上肠球菌性心内膜炎发病日益增多,为了更好地研究肠球菌心内膜炎,本实验拟首先建立肠球菌心内膜炎兔动物模型,然后原核表达粪肠球菌心内膜炎抗原(efaA)蛋白,为临床肠球菌心内膜炎致病机制、诊断防治及寻求非抗生素疗法奠定基础。 方法: 1.动物模型建立:静脉导管插入术建立肠球菌心内膜炎动物模型。模型建立后解剖取兔肺动脉瓣赘生物,通过称量赘生物湿重、计数赘生物分离培养落数、菌落PCR检测、肺动脉瓣病理组织学HE染色,综合评价模型是否建立成功。 2. efaA蛋白的原核表达及纯化:Genebank中获得efaA基因全长。PCR扩增efaA基因片段,基因克隆技术构建pET30a-efaA重组载体。采用氯化钙共沉淀法将重组子转化至E.coli DH5α和BL21(DE)。PCR、酶切、测序方法鉴定阳性重组子。IPTG诱导BL21(DE)细菌重组肠球菌efaA蛋白表达,SDS-PAGE、Western Blot方法分析鉴定。His.Bind纯化试剂盒,分析重组蛋白的可溶性,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析。 结果: 1.成功建立肠球菌心内膜炎兔模型,兔心内膜炎模型心脏可观察到有赘生物生成。肺动脉瓣赘生物重量是148 mg;赘生物匀浆后分离培养菌落计数为8.91 log10CFU/g;菌落PCR检测观察到与目的条带大小一致的特异性条带;肺动脉瓣病理组织学HE染色观察到有大量炎性细胞浸润,并见大量由血小板、纤维素、坏死组织、炎症细胞、大量细菌及肉芽组织所构成的赘生物附着在动脉瓣膜组织上。 2.成功构建PET30a-efaA重组子,在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白,获得小量纯化的重组蛋白。 结论: 1.成功建立肠球菌心内膜炎兔模型,该模型存在细菌性心内膜炎,有大量赘生物生成。 2.在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白并小量纯化,为进一步大规模表达和纯化efaA蛋白,研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定基础。
【图文】：

麻醉后兔子取背侧位，固定四肢，颈部皮肤用 75％乙醇消毒。顺气管右侧切一 3～5 cm 切口，暴露颈外静脉，丝线结扎，，在颈外静脉结扎近心端 1～2 cm处止血夹夹住颈外静脉，然后在两处结扎之间眼科剪剪一斜切口，将导管插入血管内然后移除止血夹，小心将引导管缓慢插入兔子右心室，量取切口处至兔子右心室距离约为 8 cm，移出引导管。根据引导管长度截取相当长度的聚乙烯导管。聚乙烯导管顶部约 2cm 处做粗糙处理，然后将聚乙烯导管缓慢轻轻插入颈外静脉，丝线外固定。然后导管顺右颈外静脉插入大约 8 cm，结扎固定好导管，剪去结扎线以外过长的导管末端，止血钳闭合导管游离端并观察导管搏动情况。最后丝线缝合好游离导管上端的皮肤切口。（图 1－4 所示）

丝线外固定。然后导管顺右颈外静脉插入大约 8 cm，结扎固定好导管，剪去结扎线以外过长的导管末端，止血钳闭合导管游离端并观察导管搏动情况。最后丝线缝合好游离导管上端的皮肤切口。（图 1－4 所示）图 1：分离颈外静脉并用丝线结扎图 2：根据引导管插入长度确定留置导管插入长度
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R-332

【共引文献】

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本文编号：2587109