抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

发布时间：2020-03-18 11:06

【摘要】：目的：克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因，构建其表达载体并在原核细胞进行功能性表达。方法： 用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)，以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和(链的基因，重组到Fab表达载体中，在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab;根据前导肽序列设计引物，克隆抗p185的Fd段和κ链基因，获得其氨基端原始序列；根据原始序列设计引物，通过PCR介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列；以NIH3T3/erbB-2细胞ELISA法 、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和(链的基因，在大肠杆菌中表达出Fab段但无特异性抗原结合活性；采用噬菌体抗体库技术建立噬菌体抗体库，反复筛选均未筛出阳性克隆；分别将Fd段和(链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后，，终于得到可与转染erbB-2基因的3T3/erbB-2细胞结合的小分子抗体。通过比较突变前后Fab段的分泌表达，发现无论轻链或重链可变区氨基端序列的变化均不影响Fab段的分泌量，而是影响了抗体和抗原的结合。单独恢复重链可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复轻链后活性未见进一步提高，反而有下降的趋势。提示在与抗原结合的过程中，重链的作用是主要的，同时轻链也可影响抗体与抗原的结合。结论：成功构建了抗p185小分子抗体Fab的表达载体并进行功能性表达，为进一步构建抗抗p185 鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础；进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性，为今后以PCR方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。
【图文】：

3图 1-2、可溶性 Fab 表达载体 p3MHS 图谱Fig.1-2 soluble Fab expression vector p3MHS1．2 寡核苷酸引物：自第一骨架区扩增Fd和κ链的PCR 通用引物：参考文献[33]，加以适当，设计如下:κ链5' 端引物MK5 1～3 引入内切酶SacI位点， κ链3' 端MK3引入XbaI位点； Fd段5' 端引物MH5引入XhoI位点， Fd段3' 端引13引入SpeI位点(下划线部分)。(W=T/A，K=T/G，S=C/G，Y=C/T，M=C/

PCR 扩增杂交瘤抗体基因CR 产物; 2: Fd 段 PCR 产物重组到 pGEM- T 载体。经筛选，挑白色克隆，培养aI 鉴定κ链，可见质粒经入片段，表明有κ链 的 的原载体带和 700bp 的 F
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】

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4 李竞,王琰,李全喜,王雅明,徐建军,王力民,董志伟;抗胃癌鼠单抗 3H11V 区基因的克隆及人-鼠嵌合轻链的表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;1997年03期

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本文编号：2588637