间充质干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化

发布时间：2020-03-20 10:36

【摘要】：间充质干细胞(MSC)起源于中胚层，主要位于成体骨髓和人胎儿脐血，与造血干细胞共存。MSC不仅参与构建造血微环境，发挥支持造血的作用；而且在动物出生后仍然维持一定程度的自我更新能力，以及具有分化为多种类型细胞的潜力，属于成体多能干细胞范畴。自1867年Cohnheim首次提出骨髓基质中含有非造血干细胞，以及1976年Friedenstein用贴壁法粗糙提取出骨髓中该种细胞成分以来，多个实验在含动物血清的培养基中建立了稳定扩增的骨髓MSC细胞培养体系。2000年，Erices从人脐血中也分离出MSC，建立起与骨髓MSC类似的髓外来源MSC的细胞培养。近来研究表明，骨髓和髓外来源的MSC在体内外诱导条件下，不仅能够分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌细胞等中胚层细胞，而且可以跨越胚层的限制，横向分化(TD)为外胚层起源的神经元。MSC向神经元的诱导分化，有Sanchez-Ramos建立的以生长／营养因子为主的模式，和Woodbury建立的有机诱变剂(抗氧化剂)为主的方案。诱导后的MSC可检测出nestin，trkA，NSE，NeuN，NF-M，tau等多种神经元／神经干细胞特异性蛋白的表达。本实验分离及培养了人脐血和兔骨髓两种来源的MSC，观察细胞的冻存和复苏，以及贴壁、生长与扩增规律，并使用MTT比色实验绘制不同状态MSC的生长曲线。采用调整的Woodbury方案，即β-巯基乙醇(BME)低剂量(≤3mM)、短时程(≤2h)诱导兔骨髓MSC向神经元分化，并在诱导后继续培养，免疫细胞化学鉴定诱导分化和分化后培养细胞的阳性率。尝试使用膜片箝全细胞记录的方法记录诱导前后MSC的钾离子电流的变化，以反映细胞的电生理功能郑州大学20(抖年硕士研究生学位论文间充质干细胞的体外培养及向神经元的诱导分化状态。实验数据用“均数”或者“均数士标准差”表示，样本间比较采用方差分析，检验水准均为a=0 .050 结果显示:1人脐血MSC体外培养呈现细胞的多样性，未形成融合状态，不能连续多次传代(传代蕊3)。兔骨髓MSC在3w左右建立稳定扩增的原代培养，细胞形态均一，排列有序，体外培养16代以上无变化。2细胞经过多次传代，MTT比色实验证实生长特性不变，功.05);冻存后复苏细胞的扩增暂时减慢，传代后恢复。3向神经元诱导分化后，免疫细胞化学检测结果显示:兔骨髓 MSC表达NSE以及nestin，其阳性率分别为70叹产73%和37%~38%，与对照组相比有显著差异(厂0.05)。继续培养，阳性细胞率无明显变化，闭.05)。4诱导前后的兔骨髓MSC直接贴附于底面或者贴附于赖氨酸处理的底面，一定时段内，能够与微电极尖端形成高阻封接(giga-sealing)，提示可进行全细胞记录，为进一步的离子通道的检测提供基础.但目前尚未记录到离子电流的活动。结论:1.兔骨髓MSC能够建立稳定的连续传代的体外培养，冻存后复苏的细胞形态和特性不变。人脐血中含MSC，有可能建立同样的培养.2.兔骨髓 MSC经BME诱导可表达nestin和NSE;诱导后的MSC(神经干细脚神经元) 在神经培养基继续培养，存活且分子标志的表达无增减。3.在本实验条件下，体外培养的兔骨髓MSC诱导前后，，均未记录到电流活动。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】