人类珠蛋白基因转录水平的定量技术及其初步应用研究

发布时间：2020-03-26 03:34

【摘要】： 人类红细胞的血红蛋白是由α-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽 链及β-珠蛋白基因簇编码的两条珠蛋白肽链组成的四聚体。α基因簇位 于16号染色体，含四个功能基因，依次为5’-ζ-α_1-α_2-θ-3’；β基因 簇位于11号染色体，含5’-ε-~Gγ-~Aγ-δ-β-3’五个功能基因。人类各珠 蛋白基因表达具有一定的时间性及空间性，对每一类基因，某一阶段仅 表达一个或以一个基因表达为主。当某一基因发生突变，其转录效率， mRNA的稳定性，及编码功能等都可能不同程度地发生异常，并可能影 响同簇其它基因的表达。地中海贫血即是因珠蛋白基因异常而引起的一 种主要在儿童期起病的遗传性溶血性贫血。人们根据突变珠蛋白基因的 不同而将其分为α-，β-，δβ-，及γδβ-地贫等四种类型。本病在地 中海沿岸，东南亚及我国的广东，广西，四川等地高发，对儿童健康影 响很大，目前尚无有效的治疗手段。对突变基因，正常基因的研究，有 望为临床治疗疾病提供理论基础。 近年来，随着分子生物学的快速发展，人们在基因水平已对地中海 贫血的分子机制进行了深入而广泛的研究。而基因工程技术的日渐完善， 亦为人们研究珠蛋白基因调控机制提供了有效的手段，这些均使人们日 益注重基因转录表达的研究。为此，一个行之有效的检测珠蛋白基因转 录水平的方法迫切需要建立。 国外已往的研究，多采用RT-PCR法，亦有采用探针法对珠蛋白基 因转录水平进行定量。但每次仅局限于2-4种珠蛋白基因，在同时研究 各种类型地中海贫血甚至复合型地中海贫血的致病机制，及全面系统地 研究珠蛋白基因表达切换规律，研究基因调控机制等时，其应用即受到 限制。而国内在此领域的研究开展得不多。目前尚未见同时对七种珠蛋 白基因转录水平进行监测的报道。 本研究的目的即是建立一个能同时对7种珠蛋白基因（α，β，~A γ，~Gγ，，δ，ε，ζ）转录水平进行定量的方法。由于探针定量法RNA需量 大，尤其对儿童不适宜，且RNA易降解，操作时条件要求高，因此我们 D 选用盯－pCR t作为定量方汪。D l 在外周血中含量高，尚含RNA，故被用于珠蛋白某因转录的研究中。在l D 本研冤中我们宜先对外周血网织红细胞的分离方法进行了改良，配制出D D 一种可高产量分离网织红细胞的细胞分离液，并将与常用的淋巴细胞分D l 离液相比较，证明效果好，产量高。我们又对细胞质 NA提取方法进行 l DJ叹臣，经勺并腑氰限肌活比牧，显不广重同，和盯少，且N＠叮捉脐D D 口＊A，尤耳适用于地窗等需同肘对其某因水平讲行定体研究时。巾干同D D 族坏蚤曰基凶的问源性很局，在拨计引物时，除考虑W密码于的兼D l 最终自行设计出 13条共七对引物，经基因库拟合，确证特异。且产物片 l D 段众皮与狈朋阴一致。在硼定仅匝怀杀组成过程中，多次对＊才”浓度进D D 行调整，最终确定 17．5－20mM为适宜浓度。在 PCR参数选择上，经多次 D l＆索条件，当 94’C，50’C及 72’C各 lmin时，即可全部扩增出 7种产物，l D 优化实验条件时。将每个循环的退火时间缩短30s。。，延伸时间缩短D 120see，仍可得到特异的产物，但每次循环时间可节约 25分钟。l D 利用新建的方法从脐血，正常婴儿及成人外周血中分离网织红细胞，D l 提＆ RNA后，进行 RT－PCR 显示随着年龄的增长，胚胎型珠蛋白基因 l Iy，。的相对量呈下降趋势，表现为。Iy．mopA从脐血的 0．54，到 61 l 月时的 0．87，成人的 1刀5。a／。－mRNA自 1．42，1．76，到 2．36，符合已 l D 知基因表达切换规律，即在个体发牛发育过租中．琳胳型珠蛋R某田优D l 无农这，随二渐被具他成人型基囚代督。且叶Y－mRNA的变化与HbF l 阴要化一欺。验证了本方法的可信性。进一步又对7例地中海盆血患者l lgn＃ffi臼 iRNA作出相对定量，在两例携带 Q．地贫 l＄因的患者中，l D 检测到 g－mRNA RT－PCR产物，同时 a．mANA的 RT－pCR产物量明显下 D D 降，符合缺失型突变的预期的致病机理。旷纯合子较p’双重杂合子的D Da川－mRNA低，而旷杂合子则比其纯合子低．与预湖结讼一＠。以佑D D 外培养的淋巴细胞提取的RNA作空白对照，用RTPCR检测珠番白某田D D 转求水干，5份标本结果全阴，初步显示此方法假阳性率低。D l 此足重万法侧步叹用显不，结果可靠，省时（较以前方法至少节约l l 三分之二时间），假阳性率低。l 1．4．l I 此定量方法除可在各种地中海贫血突变基因的致病机理及人类珠蛋 D 白基因表达切换规律的分析中应用外，尚可用于药物调控珠蛋白基因表 D 达机理及珠蛋白基因表达调控机制等的实验研究中。由于
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R346

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本文编号：2600890