人单核细胞表面晚期氧化蛋白产物结合蛋白的分离

发布时间：2020-03-27 06:27

【摘要】： 晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPP)是Witko-Sarsat等于1996年首先报道的由尿毒症血液透析患者血浆中分离出的含有双酪氨酸的蛋白交联产物,系因患者体内过高的氧化应激水平导致各种蛋白质氧化损伤所形成的终末产物的总称。AOPP随着慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure,CRF)及氧化应激的进展,在患者的循环和组织中潴留,是一类新的尿毒症毒素。现已明确,AOPP是一种炎症介质,单核/巨噬细胞是其选择性作用的靶细胞。AOPP能够激活单核细胞,刺激TNF-α、IL-6、IL-1等炎性因子的合成释放,促发细胞的炎症效应,参与CRF患者全身微炎症状态的发生发展,是CRF免疫功能紊乱、加速性动脉粥样硬化、透析相关性淀粉样变等长期并发症的重要致病环节。然而,AOPP一旦形成即不可逆,并且是高分子量蛋白聚合物,血液透析的清除效果极其有限,使得目前在针对AOPP的治疗上存在很大的局限性。因而由其作用途径入手,寻找干预靶点,阻断其毒性作用,并在此基础上筛选合适的药物或设计新的清除方式应是针对AOPP治疗的发展方向。因此,对AOPP作用途径和机理的研究显得尤为迫切和重要。迄今为止,我们对AOPP发生作用的途径和机理尚不清楚。现有研究发现,AOPP与另外一种同属化学修饰蛋白的尿毒症毒素-晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGE)在形成、结构以及生物学作用上极其相似,两者关系非常密切。AGE是蛋白质非酶糖化氧化的终产物,也是一种炎症介质,通过细胞表面的几种AGE结合蛋白发挥作用,其中认识最清楚的是AGE受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE),主要分布于单核/巨噬细胞表面。因此我们推测:单核细胞表面可能也存在AOPP的结合蛋白,由此结合蛋白介导AOPP的生物学作用。为了验证这一推测,本课题首先在体外制备分离高纯度、有活性的AOPP-人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA),随后建立以AOPP-HSA为靶点的生物传感器技术平台,在此技术平台上,通过配体垂钓的方式,由单核细胞膜中定向分离AOPP结合蛋白,初步探讨AOPP的作用途径和机理,为寻找可能的干预靶点,阻断AOPP的毒性作用,探索临床防治CRF并发症的新途径奠定基础。
【图文】：

洗脱曲线,洗脱曲线,分子量,预分离

第三军医大学博士学位论文峰分子量为 700kD，第二峰分子量为 67kD，参照 Witko-Sarsa这两个峰分别对应高分子量－AOPP(High molecular weP)和低分子量－AOPP(Low molecular weight-AOPP，LMW-AO分子量蛋白。全部洗脱液经分部收集、检测 AOPP 浓度，出现了管)，恰好与第一峰重叠，其余各峰尽管均能够检测到一定浓度显的峰形。因此收集第一峰与 AOPP 峰的重叠部分即为凝胶层SA，，可能是 HMW-AOPP(见图 1-1-6)。分别测得其中 AOPP 的白含量为 2.24mg/ml。此步对粗纯品的预分离将 AOPP 纯化了度/此步分离组分的 AOPP 浓度)。

凝胶层析,柱分离

图 1-1-6 AOPP-HSA 粗纯品的凝胶层析Fig.1-1-6 Gel chromatographic fractionation of crude AOPP-HSA胶层析分离组分的阴离子交换－HPLC 分离结果现有的文献资料中未检索到有关 AOPP-HSA 等电点的信息，无类，尝试的方法是使用阳离子交换柱 Mono－S 和阴离子交换柱下分别在流动相 pH 5.0 和 pH 8.0 条件下进行预实验，比较分离情S 柱分离效果欠佳，主要表现为分离峰的数目过少，且峰形不 8.0 时 Mono－Q 柱分离效果良好，可以分离出四个峰，峰形尖将流动相 pH 值改为 7.4，分离效果无明显变化，因此选择 MoPLC，于 pH 7.4 的条件下进行分离。此时可见四个峰分离清晰时间适当(第一峰前面的峰为穿过峰)。其中第一峰面积占总面积 12.467min，并与唯一的 AOPP 峰重叠(第 12－16 管)，合并各AOPP-HSA，分子量为 700kD(见图 1-1-8、表 1-1-4)。经检测，
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R341

【参考文献】