小鼠瘦素的原核表达及纯化

发布时间：2020-03-29 04:03

【摘要】：瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene，ob基因)的产物，具有抑制摄食、调节脂肪沉积与能量代谢的功能。1950年，Ingalls等首次发现并提出了ob基因的概念。1994年，Zhang等应用定向克隆技术，克隆了人与小鼠的ob基因。Leptin的作用除与肥胖有关外，对多种生理过程都有调节作用，诸如生热作用、免疫系统调节作用、青春期的始动作用、生殖功能等。重组人leptin对于部分肥胖、糖尿病患者以及leptin缺乏的个体或脂肪萎缩性糖尿病患者具有一定的疗效。 本研究以克隆有小鼠肥胖基因的质粒pMET mouse leptin为模板，PCR扩增小鼠的ob基因，定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)，，构建重组表达质粒pET-28a-lep。经酶切、PCR鉴定和DNA序列检测正确后，转化至E．coli BL21中，构建工程菌株BL21-pET28-lep。37℃培养，经IPTG诱导后，小鼠瘦素融合蛋白以包涵体形式高效表达。加入十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)，采用直接处理菌体的方法进行包涵体的变性与复性，达到了较好的效果。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示，工程菌株BL21-pET28a-lep正确表达了带有His Tag的小鼠瘦素融合蛋白，所表达的融合蛋白分子量为22.5 KD，大小与理论值相符；IPTG诱导6h，融合蛋白具有最高表达量。薄层色谱分析结果显示，目的蛋白最高表达量为菌体总蛋白的39.2％。 应用Ni~(2+)亲和交换柱进行了His融合蛋白的纯化，纯化后的融合蛋白含量为1.086 mg／ml。 综上所述，运用原和表达系统成功表达了小鼠ob基因，并应用Ni~(2+)亲和交换柱进行了His融合蛋白的纯化，这些为进一步研究小鼠瘦素融合蛋白的结构、生物活性以及与其它相关蛋白的关系等提供了基本的方法和手段。
【图文】：

LR为单跨膜受体，由胞外、跨膜和胞内三个结构域构成，对LR基因转录后形成的RNA加工方式不同，形成各种LR异形体。根据胞内结构域氨基酸序列及不同长短，将LR分成长受体和短受体两种亚型。如图1.2所示，已发现的LRa、LRb、LR。、LRd、LRe五种异形体的胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结图1.2瘦素受体异形体结构示意图(引自Weigle，D.5.etal.seieneeandmedieine.1997，4，p40)Figl.2thesructUresofdifferentlePtinreeePtors(adaPtedfromw匕lgle，D.5.etai.Seieneeandmedieine.1997，4，P40)构域的29个氨基酸序列完全相同

现进行性向心性肥胖、高血糖和不育(图和高血糖发生过程没有明显的影响，但加因突变小鼠(apoE一LDLR-l-zdb/db)遗传基验室研究结果)。因此，该类多基因突变尿病等多因素诱导下的AS发生机理和各义的。素作为减肥治疗药物，正在进行的研究包用表达产物治疗人肥胖症及其相关疾病低脂肪组织数量的效应已经在ob/ob小鼠/db小鼠没有减肥效果。我国学者成功因小鼠[57]，在研究瘦素功能异常与其它用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

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本文编号：2605410