携t-PA基因真核表达质粒构建及其转染血管内皮细胞的实验研究

发布时间：2020-04-05 00:53

【摘要】： 目的：克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1(+)/t-PA质粒载体。 方法：采用高效Trizol试剂快速从胎儿肺组织中提取RNA，RT-PCR获得t-PA cDNA，扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切，前者纯化回收大片段，后者纯化回收1.9kb片段，再将回收的pcDNA3.1(+)大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组。对重组pcDNA3.1(+)/t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定，并测序。 结果：成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因，并构建了以pcDNA3.1(+)为载体的真核表达质粒载体。重组的pcDNA3.1(+)/t-PA经HindⅢ单酶切后出现了一个6.9kb片段、经HindⅢ和BamHI双酶切后出现了5.0kb和1.9kb两个片段，测序结果证明为人全长t-PAcDNA。 结论：含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础。
【图文】：

亚庆医利·人学硕十学位论文作双酶切(Hindlll和BamHI)电泳鉴定。单酶切(Hindlll)电泳鉴定。段序列的测定量抽提和纯化重组质粒，由上海基康生物粒中t一PA基因片段进行序列测定。的扩增物，对胎儿肺组织中的t一队进行RT一PCR其中含酶切位点、强启动子、起始密码子

随机挑取菌落进行扩增培养，琼脂糖电泳筛选阳性重组质粒(约6.gkb)，以此重组质粒为模板，用PCR法扩增出约1.gkb的t一队基因片段;同样，用Hind111和BamHI双酶切重组质粒也可分离到1.gkb的基因片段。结果见图1一3。5000bP20D0bP1000bP图1一3pcDNA3.1加PA重组质粒鉴定结果①重组质粒peDNA3.1(+)/t一PA的Hindlll/BamHI双酶切②空载体质粒pcDNA3.1(+)的Hindlll/BamHI双酶切③重组质粒pcDNA3.l(+)/t一PA的Hindlll单酶切④重组质粒peDNA3.1(+)/t一PA的PCR扩增结果⑤DNA标准Figl一3TheresultsofidentificationofreeombinantPlasmidPcDNA3.1(+)/tPA①ReeombinantpeDNA3.l(+)/t一PAdigestedbyenzymeHindlllandBamHI②P1asmidpeDNA3.1(+)digestedbyenzymeHindlllandBamHI③ReeombinantpeDNA3.l(+)t一PAdigestedbyHindlll④ReeombinantpeDNA3.l/t一PAamplifiedbypCR.⑤Marker
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q782

【参考文献】

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本文编号：2614300