衰变加速因子（DAF）对Jurkat细胞增殖效应的影响及其信号传递机制的初步研究

发布时间：2020-04-07 22:53

【摘要】： DAF（decay-accelerating factor，DAF）又名CD55；是一种GPI （glycosyl-phospatidylinositol）锚固型补体调节蛋白。它以糖基磷脂酰肌醇链锚固于细胞膜外层，广泛分布于造血干细胞、外周血细胞及其它多种组织细胞表面，通过加速C3及C5转化酶的衰变和阻止C3及C5转化酶的装配，抑制补体两条激活途径的活化从而保护自身正常组织免受补体损伤。 DAF是一多功能分子，除补体抑制功能外，还可参与细菌、病毒微生物的粘附作用和T细胞及单核细胞活化等免疫反应过程。已有实验证实抗体交联DAF可诱导单核细胞、粒细胞及外周血T淋巴细胞活化，抗体交联DAF与痕量PMA协同刺激能诱使T细胞发生增殖效应。GPI锚固蛋白参与信号转导的机制已成为国内外研究热点之一，业已证实GPI锚固蛋白缺失可影响T细胞的信号传递及细胞增殖效应。而体外用抗体交联细胞表面的多种GPI锚蛋白均可使细胞活化。近来研究资料表明GPI锚固蛋白与跨膜蛋白分子的随机分布方式不同，GPI锚固蛋白在细胞膜上是以膜微区形式分布，且已证实此膜微区中富含Src家族酪氨酸激酶及G蛋白等众多信号分子，说明膜微区是介导GPI蛋白信号传递的重要结构。为探讨DAF对T细胞增殖效应的影响及可能机制，本实验以CD3~+与 CD3~-Jurkat细胞为实验模型，采用MTT比色实验观察抗体交联针对DAF SCR3区的单抗DG3与固相化CD3mAb协同作用对CD3~+与CD3~-Jurkat 细胞增殖效应，~3H-TdR掺入CTLL细胞增殖实验检测细胞培养上清IL-2 分泌水平，细胞 ELISA检测 JUrkat细胞表面 IL－ZR a链的表达水平。结果显示交联DG3与固相化CD3mAb对CD3”Jurkat细胞有较明显的促增殖效应、并可促进其 IL－2的分泌与 IL－ZR a链的表达，而对 CD3haat细胞则无此作用，该效应可被Src家族酪氨酸激酶0TK）特异性抑制剂PPZ所抑制。因此提示作为一种GPI锚联蛋白，交联CD55mAb可通过协同固相化CD3mAb促进Jurkat细胞几－2分泌与IL－ZR表达水平增加而促进细胞的增殖效应，该效应是通过Src家族PTK所介导的。为了进一步探讨DAF的介导的信号传导机制，我们应用Western blot 增强化学发光技术分别观察交联CD55mAb与CD3mAbs分钟后CD3”与 CD3刁urkat细胞的总蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化，结果显示二抗交联 DAF单抗 DG3或 CD3mAb均可使 CD3＋Jurkat细胞的细胞总蛋白酪氨酸磷酸化水平增加，但细胞总蛋白磷酸化谱有所差异，提示DAF与CD3介导的细胞信号传递通路有所不同。兔疫共沉淀实验检测到CD3“与CD3刁urkat 细胞 DAF均可与＊与 fyn的共沉淀，表明 DAF诱导细胞信号传递主要是通过PTK所介导的。为探讨膜微区在DAF介导的Jurkat细胞信号传递中的作用，实验中采用温和非离子去污剂 Tri。l－100，在低温下用不连续蔗糖密度梯度离心的方法成功抽提了CD3＋JUxkat 细胞膜去污剂抗性的膜成分（detergent－Insoluble glycolipid emohed domain，DIG），，获得了分离良好、特异性高的＊样品，在此 DIG中检测到有 Src PTK以及 DAF的特异性聚集，提示 DAF与 Src PTK的相互联系是以膜微区为结构基础的。免疫荧光共聚焦扫描显微技术分别检测了CD3勺Urkat细胞在静息状态与交联状态下分子对去污剂Triton－X100的抗性，结果显示在细胞静息状态下CD3对去污剂无抗溶性，表现为去污剂处理后，细胞免疫荧光显色明显减弱，荧光分布弥散化，而DAF与＊有抗溶性，表现为去污剂处理后细胞兔疫荧光存在有局限性聚集且聚集处荧光无明显减弱。单抗交联后，CD3对去污剂抗性有所增加。甲基B环糊精（MpCD）处理细胞可特异地抽取胞膜表面胆固醇从而破坏微区结构，实验中观察到未交联及交联状态CD3与DAF Vll ＞去污剂可溶性均增加，在静息状态下＊相对集聚于膜微区的能力也减弱。综合上述结果，可以得出以下结论：DAF不仅可作为补体调节因子调节补体活化，还可以通过加强 CD3诱导的 IL2分泌与 IL上 a链的表达而协同诱导T细胞活化与增殖；抗体交联DAF可使Jurkat细胞的发生信号传递事件，该效应主要是通过其所连接的Src家族PTK所实现的；交联 DAF介导的细胞活化能完成T细胞活化早期事件，但最终完成T细胞增殖和细胞因子分泌等晚期事件还需要有TCWCD3共同参与；静息状态下DAF 与Src家族PTK特异分布于膜微区中，因此生理条件下膜微区可辅助CD3 诱导传递T细胞活化信号。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392.12

【参考文献】