蛇毒cystatin分离及其合成基因在COS7细胞中的表达

发布时间：2020-04-11 07:10

【摘要】：目的 1、中华眼镜蛇毒cystatin的分离并探讨其体外抗肿瘤细胞侵袭的能力; 2、探讨蛇毒cystatin合成基因在真核表达系统(COS7)中的表达。方法 1、运用亲和层析、凝胶过滤等方法,从中华眼镜蛇毒中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin);通过酶抑制动力学、液相色谱分析、SDS-PAGE等方法鉴定其理化性质;并运用体外重组基底膜实验分析蛇毒cystatin对B16小鼠黑色素瘤细胞侵袭转移能力的影响。 2、根据中华眼镜蛇毒cystatin蛋白的氨基酸序列合成cystatin基因的四个片段,通过缓慢退火PCR的方法将其拼接为完整的cystatin基因;PCR扩增蛇毒cystatin基因;构建携带蛇毒cystatin基因片段的真核表达载体;脂质体介导的基因转染法将重组质粒转染COS7细胞;SDS-PAGE分析表达产物;ProBondTM蛋白纯化系统纯化融合蛋白,Western-blot鉴定。结果 1、通过凝胶过滤、亲和层析从中华眼镜蛇毒中分离得到一小分子量半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin),经酶抑制动力学分析,该小分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显抑制木瓜蛋白酶(papain)的活性;经高效液相色谱分析该活性物质为单一组分。 2、该小分子cystatin在体外重组基底膜侵袭实验中具有抑制B16小鼠黑色素瘤细胞侵袭的能力。 WP=4 3、构建了携带蛇毒cystatin基因片段的重组质粒pcDNA3.1/His C-Cystatin,经双酶切鉴定和序列分析证实蛇毒cystatin基因已正确插入质粒载体的多克隆位点。 4、经SDS-PAGE分析表明转染重组质粒的COS7细胞表达融合蛋白。该融合蛋白经ProBondTM蛋白纯化系统(Invitrogen公司)纯化后,经Western-blot鉴定其为蛇毒6×His-Cystatin融合蛋白,分子量为15000道尔顿,与融合蛋白的理论分子量相符。结论 1、从中华眼镜蛇毒中分离得到一种新的小分子量cystatin,它具有抑制B16肿瘤细胞体外侵袭的能力。 2、蛇毒cystatin重组蛋白在COS7细胞中表达并纯化,为进一步研究其生物学活性及抗肿瘤转移功能奠定基础。
【图文】：

曲线,粗毒,洗脱峰,酶抑制

图 1-3 分子筛层析分离粗毒.1-3 Separation of crude venom by molecular sieve chromatograp层析子筛层析分离得到的具有抑制木瓜蛋白酶活性的洗脱峰 IV 上样于pain-Sepharose4B 亲和层析柱中，用0.05 mol/L Na3PO4缓冲液（pH 1l，以每管 2 ml 收集洗脱液，用紫外分光光度计在 260nm、280nm 下光值，绘制“洗脱体积—光密度值（OD280）”曲线，可以得到一个和洗脱峰（如图 1-4 所示）。将该亲和洗脱峰进一步进行酶抑制活力Elution volume(ml)

序列,质粒,结构示意图,公司

图 2-1 质粒 pcDNA3.1/His C 结构示意图Fig2-1 Map of pcDNA3.1/His C vectors 主要试剂和工具酶：DMEM 购自美国 Gibicol 公司，新生牛血清购自杭州青公司，胰蛋白酶购自上海生工生物工程公司。碱性磷酸酶（CIP）、限制切酶（XbaI ，KpnI）和 T4DNA 连接酶为 BioLab 公司产品。脂质Lipofectamine 2000）和 Geneticin（G418）购自美国 Invitrogen 公司。PC盒购自 Roche 公司。小量质粒 DNA 提取纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自中科开瑞生物科技有限公司。ProBondTM蛋白纯化试剂盒购自 Invitrogen 公引物：根据 cystatin 基因序列、载体序列和不同的酶切位点，，应用 VectorNT件分别设计上游和下游引物，由上海中科开瑞生物公司合成。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】