硫芥诱导淋巴细胞凋亡作用及其机理初步研究

发布时间：2020-04-15 12:28

【摘要】： 硫芥是一类能直接损伤组织细胞、引起局部炎症、吸收后并能导致全身中毒的化学物质。大量研究表明，硫芥中毒可抑制免疫系统进而引发机会感染，导致败血症甚至死亡。硫芥中毒机体免疫功能抑制, 具有发生早、恢复快的特点。淋巴细胞是机体的主要免疫细胞，执行着多种免疫功能。 研究发现淋巴细胞对硫芥非常敏感, 淋巴细胞显著减少被认为是硫芥中毒致免疫系统功能低下的重要原因之一，但硫芥中毒淋巴细胞减少的细胞毒作用机理目前尚未完全阐明，因而对于硫芥中毒的早期诊断和防治仍无明显有效的措施。 目的：硫芥引起的细胞死亡方式有两种不同形式：即细胞坏死和细胞凋亡。本课题以大鼠脾脏淋巴细胞为中毒模型，探讨了硫芥诱导的淋巴细胞凋亡以及Caspase-3在硫芥诱导的淋巴细胞凋亡中的作用，期望能为硫芥细胞毒作用致淋巴细胞减少免疫系统损伤抑制的规律和特点提供更深层次的认识；同时探索以Caspases蛋白酶为靶点的新药合成，为硫芥中毒的早期检测和防治开辟新的途径。 方法：(1) 离体淋巴细胞染毒模型：分离提取Wistar大鼠脾脏淋巴细胞并进行培养。进行DNA-EB结合物相对荧光强度、DNA ladder以及细胞凋亡指数和细胞周期检测，作为硫芥中毒淋巴细胞损伤的标志；RT-PCR、Western blot、荧光定量法分析检测Caspase-3 mRNA、蛋白表达活化和Caspase-3活性等指标；采用罗丹明123标记的荧光探针检测线粒体跨膜电位；同时观察了Caspase-3抑制剂四肽(Ac-DEVD-CHO)对硫芥细胞凋亡作用的干预效应。(2) 在体动物中毒模型：将Wistar大鼠随机分为正常对照组和实验组。实验组腹腔注射硫芥(3.5mg/kg)，对照组则以等量的生理盐水代替。观察大鼠硫芥中毒的临床症状并进行记录。实验组于中毒后1d、3d、5d不同时相点活杀取材，苏木素—伊红染色检测脾脏组织形态学变化，RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达。 结果：(1) 淋巴细胞凋亡指数随染毒时间延长而呈渐增趋势，中毒后 24h仍保持较高水平。Ac-DEVD-CHO干预组，各相应时相点淋巴细胞凋亡指数较单纯中毒组显著减少。(2) 淋巴细胞DNA降解分析显示，DNA ladder“梯状”图谱随硫芥作用时间的延长而逐渐明显。Ac-DEVD-CHO干预组，DNA ladder“梯状”图谱消失或不明显。(3) 硫芥可干扰淋巴细胞生长周期，，硫芥作用后S期和G2/M期细胞迅速下降, 大量淋 WP=9 巴细胞生长阻滞在G1/G0期。(4) RT-PCR结果显示Caspase-3 mRNA表达在染毒3h后即出现转录加强，与对照组比较显著升高。(5) 硫芥可诱导淋巴细胞半胱氨酸蛋白酶Caspase-3蛋白的表达和活化，染毒后9h Pro-caspase-3表达增加，3h即可检测到前蛋白酶原的水解活性亚单位P20片段。(6) 荧光定量法显示淋巴细胞染毒后3小时Caspase-3的活性出现显著性增强。(7) 淋巴细胞Bcl-2蛋白表达中毒后9h表达减弱，其后继续下降。(8) 硫芥染毒淋巴细胞，线粒体膜去极化，跨膜电位于3h后即出现显著降低。(9) 硫芥中毒大鼠，脾脏组织形态学发生病理改变的同时，其凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达也出现了变化。 结论：上述结果提示：(1) 细胞凋亡及促凋亡蛋白Caspase-3和抑凋亡蛋白Bcl-2共同参与了硫芥的淋巴细胞的毒性作用。硫芥诱导的淋巴细胞凋亡是基因调节的细胞死亡，更确切的说是多种相关基因共同调节后的结果，它们的异常改变决定了硫芥对淋巴细胞的毒性作用。(2)Caspase-3以多种形式参与了硫芥诱导的淋巴细胞凋亡，包括基因表达，蛋白表达及活性调控，提示硫芥诱导的淋巴细胞凋亡依赖于Caspase-3途径，探索寻找以Caspases蛋白酶为靶点的新药合成作为硫芥中毒的早期防治可能具有一定的可行性。(3) 硫芥染毒前给予Caspase-3抑制剂四肽(Ac-DEVD-CHO)可干预硫芥诱导的淋巴细胞凋亡，使部分硫芥染毒淋巴细胞避免凋亡，从而减轻硫芥染毒淋巴细胞由于大量凋亡而导致的免疫功能低下或抑制，该结果提示以细胞凋亡信号通路中的关键性蛋白Caspases 家族为靶标的多肽抑制剂具有一定的应用价值。(4) 硫芥作用于淋巴细胞，可干扰细胞的生长周期，影响细胞周期的正常循环，造成细胞周期阻滞和细胞分裂增殖抑制，该作用可能是通过诱导凋亡途径实现。(5) 大鼠硫芥中毒可造成机体免疫器官—脾脏损伤, 细胞凋亡是其作用机制之一。(6)硫芥染毒淋巴细胞线粒体跨膜电位显著性下降，提示线粒体在硫芥诱发淋巴细胞凋亡过程中的重要作用， 硫芥诱导淋巴细胞凋亡的信号传导通路可能依赖于线粒体途径(细胞外途径)。 通过本课题多层次多途径的检测和研究，硫芥诱导淋巴细胞凋亡的主要途径可简单归纳如下：硫芥染毒淋巴细胞→→线粒体改变，释放凋亡相关的蛋白酶→→导致级联反应—"瀑布式"激活→→激活半胱氨酸蛋白酶家族凋亡效应因子Caspase-3→→线粒体跨膜电位的的进一步下降，各种凋亡信号形成正反馈放大效应→→最终导致DNA断裂，片段化→→细胞走向凋亡。
【图文】：

a n = 5, * P 0.01 vs contro图 4 硫芥(100μmol/L)染毒对淋巴细胞生长周期的环分别代表 control, 3h, 6h,9hFig 4 The changes of cell cycle of lymphocyte pr第二节 硫芥诱导离体淋巴细材料和一 主要试剂及药品硫芥(纯度为 97.5%) 军RPMI1640 培养基 H

硫芥(100μmol/L)诱导淋巴细胞凋亡相关基因Caspase-3mRNA表达(Pv)(x__s)
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R363

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本文编号：2628552