酪氨酸羟化酶基因转染神经干细胞及表达

发布时间：2020-04-17 12:58

【摘要】： 帕金森症（Parkinson's disease，PD）的基本病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元进行性坏死，同时神经元内多巴胺合成代谢过程中的限速酶——酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）含量下降，其结果导致纹状体区多巴胺含量的显著减少，引起各种临床症状。目前PD的非手术治疗，以补充多巴胺合成的前体物质左旋多巴（L-3， 4-dihydroxyphenylalanine，L-dopa）为主，但随着疾病的发展，存活的多巴胺能神经元及其酪氨酸羟化酶含量进一步下降，即使补充大量各类药物，也难以达到满意疗效。因此，有效地增加纹状体区多巴胺能神经元的数量，增强神经元合成多巴胺神经递质的能力，是治疗PD的关键措施。在脑纹状体内移植多巴胺能组织，以提高脑内多巴胺神经递质的含量，正发展成为一种新的治疗方法。脑内移植胚胎中脑组织治疗PD的效果得到广泛确认，但是这种方法也存在一定的局限性，首先要同时获得数个胎龄相似的用于脑内移植的胚胎非常困难，其次在伦理学上也存在激烈的争论，在很大程度上限制了这种方法的广泛应用。为了增加纹状体多巴胺的含量，研究者们将成纤维细胞、成肌细胞等经基因工程改造使之表达酪氨酸羟化酶移植到纹状体内，增加多巴胺递质的含量，以达到治疗PD的目的，但是这一类非神经源性细胞不能在宿主脑内长期存活，不能与宿主脑神经发生神经整合，作用时间较短，效果仍不理想。因此，寻找一种既能与宿主脑发生神经整合，在宿主脑内长期存活，又易于获得，易于在体外培养增殖，便与进行基因操作，表达酪氨酸羟化酶的的细胞供体源，用于脑移植治疗PD将有重要的意义。自90年代初以来，学者们在对神经发育的研究中发现一类广泛存在于哺乳动物CNS的未分化细胞。这类细胞具有自我分裂，，自我复制，自我更新及自我维持的能力，并具有多种分化潜能，研究者认为这一类细胞属于神经干细胞（NeUral Stem cells，NSCs）。神经干细胞可在体外培养，长期传代，大量增殖，在体外诱导因子的作用下可以分化发育为成熟的各种神经细胞表型，尤其是分化成熟的神经元具有完整的电生理功能，脑内移植后能长期存活，并与宿主脑细胞之间产生神经整合，建立起复杂而广泛的突触联系。由于NSCs易于获得，在体外增殖迅速，便于进行基因工程操作，是基因治疗CNS疾病的理想载体细胞。本研究中，我们从胚胎 16天（Emb仰oic day 6，EI6）V让tar大鼠前脑室管膜下周围区分离、鉴定、培养增殖了神经干细胞c同时，我们将缺陷性逆转录病毒载体NZA与多巴胺合成的限速酶基因TH一起构建了表达质粒，然后将该表达质粒转染PA3 I7细胞，收集经PA3I，包装产生的含TH－NZA具有感染能力的逆转录病毒颗粒。并将收获的h－NZA病毒感染体外培养的神经干细胞，诱导其分化后，用免疫荧光细胞化学的方法检测到了TH 基因在分化细胞内的表达。实验结果如下： 1．构建并扩增Th－NZA表达质粒。 2．分离、鉴定、大量增殖和搜集了 EI6 Wstar大鼠前脑室管膜下周围区的NSCs。 3．建立了TH－N止转染NSCS的有效方法，探索了逆转录病毒表达质粒转染NSCS的最佳条件。 4．以不同的条件在体外诱导NSCs分化为神经元和神经胶质细胞，验证了所分离的NSCS具有多分化潜能c 5．证实了转染TH－N。A的NSCS分化为神经元及胶质细胞后都能有效地表达TH，并且，NSCS的神经生物学特征不因TH－N。A的转染而发生变化。总之，本实验成功地进行了NSCs的分离、鉴定及体外培养，并完成了重组逆转录病毒载体质粒N。A－TH对NSCS的转染，证实了TH在分化细胞中的表达，我们认为可在体外培养，大量扩增，并容易进行h基因转染，且能表达TH的NSCs可以作为脑内细胞移植治疗PD的供体源。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R329.2

【相似文献】