鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

发布时间：2020-04-17 18:37

【摘要】： 机体的免疫应答是一个十分复杂的过程，由多种免疫细胞和免疫分子(膜分子和可溶性分子)参与并受到严格的调控。近来的研究表明，一组细胞膜分子即共刺激分子(costimulatory molecules)的调节性表达、相互作用及其信号传导在免疫应答过程中起着十分重要的作用，其中B7／CD28相互作用被认为是一个比较重要的信号传导途径。 编码人B7-1(CD80)分子的基因位于2q33，所表达的蛋白分子量为44-54KD，为Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。B7分子以寡聚体形式表达于大部分抗原呈递细胞(APC)表面，如活化的B细胞、T细胞、树突状细胞(DC)及IFN-γ活化的单核细胞中。一般认为，，CD28作为协同刺激分子的受体，通过与APC上B7分子的结合，起着传递信号，从而增强或放大免疫应答的效应；而CTLA-4负性调控T细胞的反应性。B7-CD28／CTLA-4介导的共刺激信号在T细胞活化，辅助性T细胞分化及效应性细胞因子分泌中起重要作用。通过增强共刺激信号，有利于肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤；而阻断共刺激信号，则可诱导T细胞特异性免疫耐受的产生，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体移植排斥的防治。因此，研制抗人B7分子的功能性单克隆抗体并研究其生物学功能，具有重要的理论研究和应用价值。 杂交瘤株的构建：以人多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞转入B7-1基因细胞株XG7-B7为免疫原，免疫BALB／C小鼠，采用B淋巴细胞杂 巨抗人87·l分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 中文摘要 交瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行杂交，采 用聚乙二醇（polyythylene glycol，PEG）为融合剂，经HAT选择培养，以小 鼠成纤维细胞转人B7－l基因细胞株L－B7为抗体筛选阳性细胞株，以转基因 细胞的母本细胞几）作为阴性对照细胞株，经免疫荧光标记分析及抗体分 泌阳性孔内细胞的反复筛选并经多次的克隆化培养，最终获得4株持续、稳 定分泌鼠抗人 B7l（CD80）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 IFll、 3H8、6H2和7B10。经快速定性试纸分析法鉴定，它们分泌的Ig类别分别为 lgGI门 门、6H2、7B10）和lgM门H8）。经体外长期传代培养和液氮冻 存后复苏，杂交瘤细胞生长良好，分泌抗体的性能稳定。 InAb的生产及纯化：采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成 的阳性率为 90％，腹水的产量平均为 75 ml／只小鼠。经 ProteinG亲和层析 法和优球蛋白沉淀法获得纯化抗体。腹水型IYLAb经纯化后，单抗蛋白含量在 0石司刀mg／ml之间。免疫荧光法分析表明，腹水型单抗的效价为 1：1000以 上，纯化后抗体蛋白用于间接兔疫荧光分析的用量为 0．25－2刀 v g6 X 10’细 胞。 为了研究单克隆抗体对B7－l 分子表达细胞的识别和结合，选择表达 B7刁膜分子的恶性淋巴瘤细胞株Ran、EBV转化的人B淋巴母细胞株、体外 诱导的DC 和人扁桃体来源的淋巴细胞作为阳性表达细胞与单克隆抗体反 应，并以人T淋巴白血病细胞株Jurkat以及人外周血T细胞作为阴性对照。 经间接免疫荧光标记分析，结果显示，4株单克隆抗体均能识别不同细胞表 达的B7．1分子。 在与法国 Immunotech公司鼠抗人 B7＊ 克隆号 1976）的竟争 抑制实验中，IFll、6H2和 7B不能完全阻断阳性对照 mAb与相应抗原的 结合，提示该3株单抗与阳性对照ab识别不同的抗原位点。采用氯氨T 法将’‘’I标记单克隆抗体，通过’HI标记单抗与未标记单抗的配对竞争抑制 法分析表明，IFll与 6H2、7B所识别的抗原位点不同，6H2与 7＊ 0所识 别的抗原位点相同或相近。在此基础上开展了用于检测SCD80抗原试剂盒的 研制工作，并初步建立了 SCD80 ELISA检测方法，提示这些抗体可能具有潜 二I 鼠抗人B7．l分于功能性单克隆抗体的研制及其主物学特性的研究 中文摘要 在的临床应用价值。 在中和／阻断试验中，以XG7书7为刺激细胞，人外周血T淋巴细胞为 反应细胞，分析抗体对T细胞增殖的影响。经3H1dR掺入法证实，IFll、 3H8和6H2均能不同程度地阻断B7－1分子介导的协同刺激信号，从而抑制 B7－1 转基因细胞对人外周血T淋巴细胞的增殖激发效应（抑制率在 21％一52％），提示这 3株单抗是阻断型抗体，而 7B对 B7－1分子介导的协 同刺激信号没有阻断作用。 以天然表达B7q分子的人恶性淋巴瘤细胞株＊
【图文】：

株杂交瘤细胞的染色体数目4Chromosomeoffourhybridomacellsdeterminingmethodwasdeseribedinthematerialsandmethods.ThemosomenumberwasobservedunderaninvertedmieroseoPe.Theeellsorethanahundredehromosomes.ItshowedthattheIFll、3H8、6H2B10werethehybridomaeells.

δ苄缘タ寺】固宓难兄萍捌渖

本文编号：2631171