恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达、纯化及单克隆抗体的制备

发布时间：2020-04-24 05:28

【摘要】：疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病，广泛流行于热带和亚热带一些发展中国家。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节，当前疟疾的发病率和死亡率难以控制的一个重要原因就是在疟疾流行区缺乏有效的诊断和治疗手段。传统的疟疾诊断方法由于操作复杂、设备昂贵、需专业人员因而难以在基层推广。近年来发展的以单克隆抗体为基础的免疫层析技术，以其快速、简便、可靠等优点在疟疾诊断中显示了广阔的应用前景，目前国外公司已开发出ParaSight-F(Becton Dickinson, Cockeysoville, Maryland, USA)、ICT Malaria P.f和ICT Malaria P.f／P.v(ICT Diagnostics, Sydney, Australia)、OptiMAL(Flow Inc, Portland Oreg)等一系列基于免疫层析的诊断试剂盒，现场评估取得较好的效果。但这些试剂盒价格昂贵，且均存在一定的局限性，因而有必要寻找一种更具有诊断价值的新型靶抗原。 恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)是疟原虫物质和能量代谢过程中一种十分重要的功能分子，对碳、氮代谢起重要作用，在疟原虫整个红内期均能表达，它催化谷氨酸脱氨基生成α-酮戊二酸，同时使辅酶Ⅰ、Ⅱ由氧化型(NAD~+、NADP~+)转化为还原型(NADH、NADPH)。研究揭示，疟原虫GDH同脊椎动物组织的GDH在理化、生物学特性及酶学方面有较大差异，如疟原虫GDH活性不受嘌吟核苷酸(GTP、ADP)的影响，而脊椎动物组织的GDH可被GTP、ADP激活或抑制。疟原虫GDH特异地以辅酶Ⅱ为其辅酶，而脊椎动物组织的GDH可以辅酶Ⅰ或Ⅱ作为辅酶。临床和实验研究证据表明，疟原虫比其宿主 细胞更易受氧化压力影响，因此参与琉基代谢及还原型辅酶ll(NADPH) 再生的脱氢酶对于疟原虫免受宿主体内氧化剂损伤及维持生存起着极其 重要的作用。疟原虫GDH被认为是NADPH生成的主要来源，而且更为 重要的是宿主红细胞内没有此酶(GDH.NADP+)。序列分析表明，来源 于恶性疟原虫海南株(FCCI似N)的GDH同泰国(Thailand)株GDH 同源性高达99%。此外，疟原虫GDH与低等真核生物、真菌、细菌的 同源性约为50%，而与人的GDH的同源性仅为23%。尽管目前没有间 日疟原虫GDH基因的有关报道，但从进化角度来看，它同间日疟原虫的 GDH可能存在非常高的同源性，提示该酶有望成为一种同时对恶性疟和 间日疟快速诊断的新型靶抗原。 本研究的最终目标是建立以GDH为诊断靶分子的免疫层析技术，使 该技术同时可对恶性疟原虫和间日疟原虫进行诊断，因此，获得同时针 对恶性疟原虫和间日疟原虫的单克隆抗体是建立该技术的关键，而一个 具有完整空间表位的重组GDH分子是建立该技术的基础。因而本研究在 已构建的GDH融合蛋白表达载体的基础上，通过分子克隆技术构建了非 融合蛋白表达载体，并分别在大肠杆菌中进行表达。通过复性和柱层析 技术分别纯化了融合蛋白和非融合蛋白，在此基础上采用杂交瘤细胞技 术制备了针对两种蛋白的单克隆抗体，并对抗体进行了初步鉴定。同时 结合胶体金标记技术和免疫层析技术建立了胶体金免疫层析测试法，并 以镜检法为参照，评价其检测恶性疟原虫和间日疟原虫的敏感性和特异 性。 结果显示，融合蛋白表达质粒pGEX一4T一1/GDH在大肠杆菌中表达产 物主要以包涵体形式存在，重组蛋白分子量约为66KDa，表达量约占菌 体蛋白的25%，将包涵体进行变性/复性，，利用二步阴离子交换层析纯化 重组蛋白，纯度约达90%。用鼠抗GDH免疫血清进行节几stem一blot分析， 表明该蛋白具有良好的免疫原性。用其制备了6株单克隆抗体，单抗的 类型均为IgGI。另外，非融合蛋白表达质粒pET23(a)/GDH在大肠杆菌 中表达产物主要以可溶性形式存在，分子量约为52kDa，表达量约占菌 体蛋白的15%，经过阴离子和阳离子交换层析纯化后，GDH纯度达90%以 上。用该蛋白制备的鼠免疫学清与恶性疟血样进行w匕stem一blot分析，发 现该蛋白具有良好的抗原性。用纯化的GDH免疫小鼠制备了3株单克隆 抗体，其中2株为IgGZa，1株为IgGI。这些抗体的亲和力常数介于lx10一” M一2.82x10一10 M. 利用所制备的9株单抗，进行了胶体金标记并建立了胶体金免疫层 析法，配对筛选出最佳诊断恶性疟原虫的组合。发现以2B9单抗为包被 抗体，而以3C3单抗为金标的抗体，其敏感性和特异性最好。以镜检法 为参照，其敏感性为86.66%，特异性为96.43%。 以上结果表明，我们在国内首次制备了抗恶性疟原虫GDH的单克隆 抗体，利用筛选的单抗建立的胶体金免疫层析法，能有效的检测恶性疟 原虫血样，为进一步开发标准化的恶性疟原虫免疫诊断商品试剂盒打下 了基础。下一步我们还将利用恶性疟与间日疟的同源性，希望能在制备 抗恶性疟GDH的单克隆抗体制备中能筛选出同时抗恶性疟原虫和间日 疟原虫的单抗，并具有高的敏感性和特异性。
【图文】：

光密度扫描表明其占菌体总蛋白25%以上，所制备包涵体纯度可达70%以上(见图1一1)。图1一1.包涵体及纯化的SDS一PAGE分析1.诱导前GDH/GsT:2.诱导后GDH/GST;3.破菌后上清;4~6.通过不同方法洗涤的包涵体;7.纯化的GDH/GST;8.蛋白分子量标准Fig.1一1SDS一PAGEanalysisofinelusionbody1.GDH/GSTbeforeinduetion:2.GDH/GSTafterinduetion:3.supernatantaftersonieation:4~6.inelusionbodyafterwashingbydifferentmethods:7.purifiedGDH/GST:8.marker二、复性(一)稀释复性在稀释复性中，采用浊度测定和非还原SDS一PAGE监控复性过程，结果表明，GDH/GST在A缓冲液复性效率最高(见表1一1)。

结果表明经离子交换层析纯化的GDH/GST重组蛋白，与免疫小鼠的抗血清在分子量66KDa处有明显的反应带，而与正常小鼠血清则无反应带(见图1一2)。123州kD)97，4陇，243，031，公20‘114.4图1一2.纯化的GDH/GST融合蛋白的Western一blot分析1.正常小鼠血清;2.抗GDH小鼠血清:3.蛋白分子量标准Fig.l一2.IdenfitieationofWestern一blotofpurifiedGDH/GSTfusionprotein1.normalmouseserum:2.mouseser皿againtGDH:3.m
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 李林海,李明,吴英松,王萍,田泽维;恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定[J];第一军医大学学报;2002年10期

2 周水森;恶性疟快速诊断新技术—Dipstick方法[J];国外医学(寄生虫病分册);1996年04期

3 宁云山,李妍,王小宁;包含体蛋白质的复性研究进展[J];生物技术通讯;2001年03期

4 江晓玲,李明,徐伟文,毕惠祥,程钢,李虎,诸欣平;恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立[J];中华检验医学杂志;2000年02期

5 翁屹,苏成芝;重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究[J];中国寄生虫病防治杂志;1994年01期

6 诸欣平,李明,董洁,周蕾,王学忠,王凤云;套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究[J];中国寄生虫病防治杂志;1998年02期

7 张龙兴,柴建华,詹斌,冯晓平;DNA探针诊断间日疟的进一步研究[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1993年02期

8 ;一九九六年全国疟疾形势[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1997年03期

9 钱会霖,尚乐园;一九九八年全国疟疾形势[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年04期

10 郑香,汤林华,许永湘,蒙锋,祝卫东,顾政诚,钱会霖;快速免疫色谱测试卡诊断恶性疟和间日疟的效果评价[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年04期

本文编号：2638580