人睾丸精原细胞分离和培养的初步研究

发布时间：2020-04-25 12:30

【摘要】： 背景与目的：随着近年来对于干细胞研究的不断深入发展和新的研究工具、实验技术的涌现，对于精原干细胞（Spermatogonial stem cell,SSC）的研究亦激起人们的浓厚兴趣。目前虽然对某些种属动物如大鼠、小鼠、猪、牛等的SSC细胞已进行初步分离、培养和移植的研究，并且在SSC的体外培养研究方面，通过对不同种属精原细胞培养条件的不断摸索，应用不同成分的培养基如DMEM、DMEM/F12、无血清培养基、富含钾离子的KSOM培养基等，已建立了多种不同培养系统，如以Sertoli细胞作为饲养层的共同培养体系、以STO（小鼠胚胎成纤维细胞无限系）作为饲养层的生殖细胞培养系统等。但是SSC作为复杂的精子发生过程的基础和前提，其生化和分子特性以及增殖、分化的生物学详细机理尚缺乏深入研究，对人SSC体外培养等的研究则更少。随着对各类干细胞研究手段的日益发展，进行人类和动物睾丸精原细胞的纯化分离、培养以及诱导分化是本领域研究的迫切需求。针对目前睾丸SSC细胞的研究现状，本课题通过应用正常人胎儿睾丸组织分离纯化获得较高纯度的人SSC，然后选择不同的培养基和培养条件进行培养，从而寻求人SSC体外长期培养的优化培养体系，并为进一步行人SSC移植和功能鉴定奠定基础。本研究分三步进行：1.进行饲养层制备：制备不同的饲养层包括小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层、小鼠胚胎成纤维细胞无限系（STO）饲养层以备用于精原细胞的培养；2.人睾丸SSC的分离和纯化：采用联合二步酶法消化、Percoll密度梯度离心、差异粘附等分离和纯化步骤获得成活率良好，含量较高的人睾丸精原细胞；3.培养条件的优化及精原细胞的长期培养观察：选择不同的培养介质DMEM、DMEM/F12、无血清培养基等在不同的共培养体系中进行细胞培养和观察，并选择可使人SSC在体外稳定存活的培养体系进行了长期培养观察。方法：实验细胞来自正常人睾丸组织（取自妊娠6个月以上合法引产胎儿）。应用联合酶消化法对睾丸组织进行消化，获得的单细胞悬液应用Percoll不连续密度梯度离心和差异粘附等方法进一步分离纯化得到人精原细胞，然后分别以Sertoli细胞、STO细胞、MEF作为饲养层并接种在DMEM、DMEM/F12、DMEM-SF三种培养基中进行体外培养。通过光镜进行形态学观察和检测，对短期培养条件下各组存活精原细胞的比例进行统计分析，对共同培养体系进行了长期培养观察，并用免疫组化方法对精原细 WP=8 胞所表达的抗原蛋白SSEA-1进行了初步检测。结果： 1、用12.5dpc的小鼠胚胎制备MEF，培养后，细胞的贴壁率较高，增殖快，细胞活率好。 2、经过两步酶消化后获得的睾丸细胞进行台盼蓝拒染（排斥）试验观察活细胞数显示，平均活细胞及死细胞百分率分别为89.71%、10.29%。 3、Percoll不连续密度梯度离心和差异粘附等方法可以有效的对人精原细胞进行分离纯化，其中精原细胞主要分布于27%~ 35%（密度为1.0410g/ml~1.0508g/ml）的梯度之间。此带中精原细胞的纯度平均达到60.42%。 4、以DMEM-SF作为培养基的三种不同的共培养体系在经过3天的培养后，精原细胞所占比例有非常显著的减少。而以DMEM/F12作为培养基的三种不同的共培养体系在经过3天的培养后，显示和Sertoli细胞共培养的体系中精原细胞所占比例最高，显著高于以STO细胞或MEF作为饲养层的培养体系。 5、精原细胞在与支持细胞的共培养体系中可以长期存活，形态学特征表现为附着于支持细胞表面直径为18-24μm的圆形、椭圆形或具有突起的梭形扁平细胞，，随培养时间的延长精原细胞在共同培养体系中相对数量有所减少，但可长期生存并扩增。 6、经Percoll分离后的精原细胞显示大部分呈SSEA-1阳性染色，表现为细胞呈棕黄色深染。经过3周体外培养后所获得的细胞经SSEA-1免疫染色，结果显示仍有多量细胞存在明显阳性染色。结论： 1、应用联合酶消化法、Percoll不连续密度梯度离心和差异粘附等方法可以有效的对人精原细胞进行分离纯化。 2、人精原细胞的长期体外培养依赖于适当的饲养层细胞的存在，而且精原细胞在与Sertoli细胞共同培养体系中能够较好的长期体外生存并扩增。 3、人胎儿精原细胞可表达SSEA-1抗原，而且经过长期培养后仍可以观察到持续表达SSEA-1的精原细胞。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329

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