乙肝病毒靶向核糖核酸酶的构建和抗病毒作用的初步研究

发布时间：2020-05-13 01:54

【摘要】： HBV感染是一个世界范围的卫生问题。相当一部分的乙肝病毒感染者，会迁延转变成慢性肝炎、肝硬化或肝癌。尽管乙肝疫苗可以预防其感染，但现有的数目庞大的感染人群、约50％的对疫苗不反应者以及可能的逃避疫苗诱导免疫的乙肝病毒突变株都迫切需要有效的治疗手段。对慢性乙型肝炎感染者的治疗，α干扰素其有效率不高(约为30％-40％)，耐受性差。核苷类似物包括lamivudine、famciclovir、lobucavir、adevfovir停药后大多数患者的病情会复发，而长期用药又会导致耐药株的出现。反义技术及核酶(ribozyme)治疗乙肝目前尚处于实验研究阶段。但反义寡核苷酸制备昂贵，难以大量合成应用于临床治疗。总之，现有的各种手段对于预防和治疗乙肝病毒的感染有一定的效果，但仍迫切需要探索治疗的新方法。1991年，Natsoulis和Boeke在Nature杂志首次提出一种新的抗病毒的策略：核衣壳导向的病毒灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVl)并将其应用于逆转录病毒的实验治疗。乙肝病毒的复制过程类似于逆转录病毒，即首先将其DNA转录成前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)，然后DNA多聚酶与核心蛋白分子将其包裹形成核心颗粒，在核心颗粒内进行逆转录与DNA的正链合成，完成病毒基因组的复制。针对乙肝病毒的复制特点，我们着手将CTVI用于抗乙肝病毒感染的研究：以乙肝病毒的核心蛋白为靶向分子，利用它们对乙肝病毒pgRNA的特异识别与包裹，使与靶向分子融合表达的效应分子——核糖核酸酶特异地与乙肝病毒pgRNA结合并切割，抑制乙肝病毒的复制。首先，以Trizol提取HL-60细胞中的总RNA。应用RT-PCR，扩增核糖核酸酶[人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)]编码基因，，克隆入puc18并测序。而后，以Trizol提取整合乙肝病毒的2.2.15细胞中的总RNA，RT-PCR扩增乙肝病毒核心蛋白(HBVc)编码基因。将扩增的hEDN及HBVc编码基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)构建融合真核表达载体pcDNA3.1(-)／hEDN-HBVc，即乙肝病毒靶向核糖核酸酶真核表达载体。同时分别PCR扩增出包含乙肝病毒核心蛋白、人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素、以及突变失活的人第四军医大学硕土学位论文中文扩昙类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素编码基因的真核表达载体PCDNA3．l卜） fIBVcalone、pcDNA3．1（－）MIDNalone、pcD＊A3．l（）’hEDNmut－HBVc作为对照。将扩增的hEDN编码基因克隆入原核表达载体pGEX4T刁，构建原核表达载体pGEX4T八／hEDN。将阳性克隆在 ECOli BLZI中进行诱导表达，纯化产物］免疫BaLB／。小鼠制备抗体，滴度1：400时做＼＼sstem blot鉴定，在M为16 000 的位置处有一条明显的带。pCDNA3卜）lffi＊C－hEDN转染 2．ZIS细胞后，以自制的鼠抗hEDN作为一抗，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察，转染 pcDN’A3千帅DN邢VC的22刁细胞出现较强绿色荧光，说明pcDNA31卜）／hEDN－HBVC可以在22＊细胞内较高表达。转染pCDNA31（－）／hEDN－HBVC、三种阴性对照质粒及pcDNA3卜斤22 15细胞同时设立空转染为全阴性对照，转染后48小时提取部分上清，应用固相放免定量分祈HBSAg含量，结果显示，转染pcDNA3（－）／hEDN－HBVC组H’bSAg比正常培养的2215细胞上清下降 58％。而其他对照表达质粒转染组与正常培养的 22is细胞上清 HBSAg含量差别无统计学意义。各组转染后细胞做＊y T比色分析，细胞增殖并没有受抑制，而且各组间差别无统计学意义。RTPCR扩增转染基因结果说明 pcDNA3．l个） fIBV卜hEDN转染组 HBSAg含量下降系由含靶向分子（HBVG）和效应分子（hEDN）的融合蛋白作用导致的，即靶向核糖核酸酶具有抗HBV的作用。以上结果表明，由于 pCDNA3个）怔DN－HBVC带有特定的靶向分子和高效的效应分子，在靶向分子自动包装HBV p酬A将效应分子带入核衣壳内效应分子可以特异性的切割 HBV pgRNA，从而抑制 HBV的复制。研究结果表明己初步成功地探索了治疗乙肝病毒感染的新途径。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

【参考文献】