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新基因dp3的克隆表达及其功能初步研究

发布时间:2020-05-13 16:57
【摘要】:以人的垂体为材料,在垂体表达谱中发现了一个内分泌组织特异表达的新基因,用RT—PCR的方法从垂体cDNA库里克隆到了该基因。通过生物信息学分析发现新基因即为E2F-Like基因,它定位于人体X染色体长臂的26.2位点上,其蛋白质具有E2F_TDP结构域,和E2F家族的DP1,DP2具有很高的同源性,故将其命名为DP3。成功地构建了DP3—1蛋白的原核表达载体pGEX—4T—1/dp3—1,筛选到最佳诱导条件为0.2mM IPTG,30℃,4hr,诱导后分离纯化得到了3mg DP3—1蛋白,用于免疫兔子以得到针对DP3—1蛋白的抗体,经过验证所得抗体的特异性和效价均很高。同时成功构建了dp3的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A/dp3,并且证明了dp3基因在真核细胞中可以较好地得到表达,采用免疫荧光定位法发现DP3蛋白定位在细胞的胞浆中。构建了中国仓鼠卵巢细胞(CHO)稳定细胞株(CHO—AB4),,在该稳定细胞株基础上采用流式细胞仪检测细胞周期,发现稳定株的细胞S期明显比对照高,DP3具有促进细胞由G1期向S期转变的作用,说明DP3在细胞周期方面具有明显的作用。
【图文】:

序列,表达谱,垂体


我们选取了44个novelEST序列,对其引物设计后,进行聚合酶链反应,经2%琼脂糖凝胶电泳,对这些PCR产物和p一actin的灰度值进行比较,获得每个基因的相对表达量。通过GeneCluster和TreeView软件分析,获得基因表达图谱图1(红色表示阴性,绿色表示阳性,灰色则介于两者之间)。由图1一1可见:大多数基因都在垂体组织中高表达,并在其它组织中(脾、肌肉、肺、心脏、皋丸、胸腺、‘肾、小肠、大脑)表达量相对较少或根本呈阴性,这提示我们:这些EST代表的基因有可能在垂体中比较特异。其中新基因(有*标记)只表达在垂体、翠丸、胸腺等内分泌组织中,在肺和小肠也有少许表达。图1一1新基因表达谱1.2特异新基因在各类群体垂体中的表达谱f一F:女性胎儿垂体:一八ro:女性老年垂体:以:男性胎儿垂体:一认成人垂体姗:.‘k,.r:男性老年垂体:1kbl奄‘dder图1一2新基因在垂体中的表达谱

序列,垂体,表达谱


我们选取了44个novelEST序列,对其引物设计后,进行聚合酶链反应,经2%琼脂糖凝胶电泳,对这些PCR产物和p一actin的灰度值进行比较,获得每个基因的相对表达量。通过GeneCluster和TreeView软件分析,获得基因表达图谱图1(红色表示阴性,绿色表示阳性,灰色则介于两者之间)。由图1一1可见:大多数基因都在垂体组织中高表达,并在其它组织中(脾、肌肉、肺、心脏、皋丸、胸腺、‘肾、小肠、大脑)表达量相对较少或根本呈阴性,这提示我们:这些EST代表的基因有可能在垂体中比较特异。其中新基因(有*标记)只表达在垂体、翠丸、胸腺等内分泌组织中,在肺和小肠也有少许表达。图1一1新基因表达谱1.2特异新基因在各类群体垂体中的表达谱f一F:女性胎儿垂体:一八ro:女性老年垂体:以:男性胎儿垂体:一认成人垂体姗:.‘k,.r:男性老年垂体:1kbl奄‘dder图1一2新基因在垂体中的表达谱
【学位授予单位】:西北大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q78

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本文编号:2662255

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