CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54、CHO-MBLm57高表达株筛选及产物生物学特性研究

发布时间：2020-05-14 12:05

【摘要】： 甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)是哺乳动物C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员，主要由肝细胞分泌，作为糖蛋白存在于血浆中。MBL通过与2个MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBL associated serine protease，MASP-1，MASP-2)结合而激活补体凝集素途径，在天然免疫中发挥重要作用。现已发现3个可导致血清(浆)MBL水平低下并进而引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变：CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，其编码产物的改变分别是Arg→Cys、Gly→Asp及Gly→Glu。这些点突变为常染色体显性遗传，其基因频率在不同种族人群中差异甚大，但总体来说极高，如第52位密码突变在所研究过的人群中相对较低(≤0.1)，第54位密码突变在欧亚人群中有较高频率(0.11～0.14)，而第57位密码突变存撒哈拉非洲人群中的频率很高(0.23～0.29)。显然，MBL缺损是迄今所发现的最常见的遗传性免疫缺损病，而各种病原体的反复感染与MBL缺损密切相关。然而，MBL基因突变引起免疫缺损的机理迄今尚未完全清楚。 本课题组曾将相同质量数的野生型和3种突变型MBL真核表达载体用脂质体法分别转染入相同数目的COS7细胞中，72h后检测各目的蛋白的分泌量。将4种(1种野生型基因转染COS7和3种突变型基因转染COS7)细胞培养上清中检测出的蛋白进行One-way ANOVA分析，发现4种细胞培养上清中目的蛋白的量没有显著性差异(P＞0．05)，由此证明，MBL结构基因点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。 既然MBL结构基因点突变并不影响蛋白的合成与分泌，那是什么原因导致了血清(浆)MBL水平低下，是突变蛋白结构不稳定还是功能异常?为了进一步阐明MBL的结构与功能的关系，揭示MBL缺损的实质，我们需要得到野生型和突变型MBL基因的稳定表达产物，以便研究其生物学特性。在本研究中，我们将本室保存的已转染4种真核表达载体(pcDNA4／HisMax C-MBLw、pcDNA4／HisMax C-MBLm52、pcDNA4／HisMax C-MBLm54和pcDNA4／HisMaxC-MBLm57)的CHO细胞株(CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57)进行为期2个月的筛选，通过双抗体夹心ELISA技术筛选得到了高效稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株，并对其表达的蛋白产物进行了较为深入的研究。将转染空载体pcDNA4／HisMax C的CHO细胞进行平行处理，作为阴性对照，命名为CHO-pcDNA4C。 一、双抗夹心ELISA体系的建立 建立了两种双抗体夹心ELISA体系，用于检测培养上清中目的蛋白的浓度，筛选稳定高效表达株。第一种夹心体系：利用MBL是多聚体的特性，捕获抗体为鼠抗人MBL-CRD mAb，检测抗体为Biotin-抗MBL-CRD mAb，推测由于空间位阻的关系，该体系检测灵敏度不够，仅为2.5 mg／L；第二种夹心体系：捕获抗体为鼠抗人MBL-CRD mAb，检测抗体为商品化HRP-抗HisG单克隆抗体，该体系灵敏度为0.3 mg／L。检测用标准品均为野生型重组人MBL蛋白。 二、野生型和突变型MBL基因稳定转染CHO细胞及其高效表达株的筛选 本课题组前期工作已成功构建含有4种真核表达载体的CHO细胞，即CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57。将上述细胞分别复苏后，在96孔板中单克隆化，待细胞克隆长至孔底的1／4后，挑取细胞株置12孔板内培养24 h后，以800 mg／L的Zeocin加压筛选。随后的1个月中，每隔3～5天换液一次，维持Zeocin浓度为800 mg／L。分别得到4、1、2、5株稳定高效单克隆细胞株，ELISA检测上清中目的蛋白浓度均达到1～2 mg／L。RT-PCR分析表明，转染4种MBL基因的CHO细胞均稳定转录mRNA。 三、野生型和突变型MBL基因在CHO细胞中的表达产物生物学特性研究 利用鼠抗人MBL-CRD mAb亲和层析柱初步纯化表达产物，Ni~(2+)-NTAagarose层析柱进一步纯化表达产物，获得野生型和突变型重组MBL蛋白。在1L培养上清中均状得1 mg左右的目的蛋白。经Western blot和ELISA鉴定，纯化后的蛋白产物可分别与抗MBL-CRD单克隆抗体、抗His单克隆抗体和抗MBL单克隆抗体结合。它们分别命名为野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突变型MBL蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot分析，发现重组突变MBL蛋白以双链(Mr约50 000)为主，而重组野生型MBL分子则以二至六聚体(Mr150 000～450 000)为主。结果表明，突变蛋白的多聚化程度远远低于野生型MBL蛋白。酵母菌凝集试验显示：人血浆天然MBL和野生型MBL蛋白能结合酵母菌细胞壁甘露聚糖，产生可见的凝集颗粒，3种突变型MBL蛋白凝集颗粒极少；配体结合实验表明，只有天然MBL和重组野生型MBL蛋白才能与甘露聚糖有效结合，3种突变型MBL蛋白与糖结合的功能低下：补体C3d沉积试验显示，3种突变型MBL蛋白不能通过凝集素途径激活补体系统。 综合上述资料及本室蔡学敏博士的MASPs结合试验结果即3种突变型MBL蛋白与MASP-1、MASP-2的结合能力降低，我们认为，CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA MBL基因点突变引起的氨基酸残基的替换影响了其产物蛋白质的结构，使之不能形成结构业单位及其寡聚体，进而影响其功能，，包括结合配体、MASPs的能力和激活补体凝集素途径的活性。
【图文】：

Fig.l一 1ThesensibilityofthesamesandwishELISAdetectingthePurifiedwildtyPerhMBL1.2.2不同种抗体夹心ELISA体系该检测体系灵敏度较高，可检测到浓度为 0.3mg/L的蛋白(图1一2) 2.5乃一任OC的寸哎 0.5 40201052.51.250.6250.3125 ConCentrationoftheWildfyPeMBL(mg/L)图卜2不同种双抗夹心ELISA检测纯化重组人野生型MBL蛋白的灵敏度 F19.1一 2ThesensibilityofthedifferentsandwishELISAdeteetingthe

后的l个月中，每隔3一5天换液一次，维持Zcocin浓度为80om妙，获得稳定转染表达载体的CHO一MBLw、CHO一MBLm52、CHO一MBLm54和CHO一MBLm57单克隆细胞株(图2一1)。对照组CHO细胞在加压9天内全部死亡。2.2.2高效表达目的蛋白细胞克隆的获得(l)在EUSA检测体系中，以鼠抗人MBL一 CRDmAb为捕获抗体，HRP-抗HisG单克隆抗体为检测抗体，检测筛选得到的各阳性克隆培养上清的A450nm值，共获得12株A450nm值)0.7的细胞克隆。(2)同时以40m叭至0.3125m叭倍比稀释的纯化重组野生型MBL蛋白为标准蛋白，测得各浓度蛋白参与该ELISA反应的OD值。以标准蛋白浓度为自变量X，ELISA检测的OD值为应变量Y，进行非线性多项式回归分析和三次模型曲线拟合(图2一2)。其决定系数扩一0.98943
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2663326