肿瘤血管生长因子受体结合抑制肽的筛选和肿瘤疫苗的构建

发布时间：2020-05-19 13:27

【摘要】： [目的]本实验试图通过能中和VEGF生物活性的单抗从噬菌体随机7肽、12肽文库中筛选一种能抑制VEGF与血管内皮细胞表面受体KDR(kinase domain receptor)结合的VEGF模拟短肽。对VEGF分子的受体结合位点进行定位，探讨小分子短肽作为血管细胞生长抑制剂、肿瘤疫苗可行性。 [方法]以两个具有中和VEGF活性的抗-VEGF单克隆抗体JH121、VG189为目标，分别对噬菌体随机7肽、12肽库进行筛选。并通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定。ELISA分析阳性噬菌体克隆与抗体的亲和力。用高亲和力克隆免疫小鼠检测噬菌体表达短肽的免疫原性。检验这种短肽可否模拟VEGF的抗原决定簇诱发机体产生能与VEGF结合的抗体，研究小鼠抗血清对HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞)生长的抑制作用以及噬菌体表达的7肽和12肽对HUVEC生长的抑制作用。 [结果]对肽库进行三轮筛选后，噬菌体克隆具有良好的富集效果。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％，通过ELISA检测与抗体有高亲和力的克隆。用筛选到的7肽、12肽阳性克隆免疫小鼠能激发产生强的免疫应答，其抗血清与VEGF的交叉反应比免疫VEGF的抗血清更强。测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列：GWYYDAL、VASAVFYSALVE。短肽GWYYDAL引起的血清在不同浓度下呈剂量依赖性对VEGF诱导的内皮细胞生长起抑制作用。说明该抗体具有阻断VEGF-KDR的作用的功能。噬菌体表达的7肽GWYYDAL、12肽VASAVFYSALVE对HUVEC的生长有明显的抑制生长作用，两种短肽都呈剂量依赖性抑制VEGF诱导的内皮细胞生长。两者可能分别模拟了VEGF分子的21、25位氨基酸和14、17、21位氨基酸通过折叠后在三级结构水平上形成的结合位点和VEGF竞争结合受体。 [结论]从噬菌体肽库中筛选到了与抗体有高亲和力的阳性噬菌体克隆，噬菌体表达的7、12肽GWYYDAL、VASAVFYSALVE模拟了VEGF的抗原表位，引起显著的抗-VEGF抗体反应。而且该模拟抗原表位可能与HUVEC上表达的VEGF受体结合，从而抑制了VEGF的促HUVEC生长作用。这为进一步定位VEGF抗原表位，研究VEGF受体结合抑制肽，设计肿瘤疫苗提供了有力的基础。
【图文】：

序列,球蛋白,激酶,丝裂原活化蛋白激酶

稍片哪弓燕浦汤石丽而花淤瓦漏正菇图2VEGFR一l扭It一1、VEGrR-2/KDR信号传导途径与VEGF结合的胞外区7个免疫球蛋白样超二结构为代表。配体磷酸化胞质区特异性酪氨酸残基(图中显示出受体氨基酸序列中R一2中，，儿个胞内信号蛋白通过受体与配体的结合直接被激活，如的几个蛋白尽管起精确的活化机制尚未清楚，但也是经VEGFR一2FAK、p38MApK、eNOS、Sre和pI3K(以?表示)。虽然Yll75具有结合PLC一r和sck的功能。缩写:eNOS二内皮一氧化氮合成酶;A丝裂原活化蛋白激酶;MEK=MAPK激酶;PI3K二磷酸醋酶3激酶脂酶C一r;PKC=蛋白激酶C;Sek=She样蛋白;SHP一2=SHZ磷酸研究进展与受体KDR的相互作用促进内皮细胞增殖及血管形成，有重要作用。阻断VEGF的生物学活性是控制肿瘤生长vEGF~KDR作用的方法是:l)抗vEGF抗体，包括单克

原理图,噬菌体展示,原理,线性噬菌体

噬菌体展示肤库是以线性噬菌体M13为载体，将基因片断克隆在外壳蛋白gln或gvm的N端，使外源基因以gln或gVm融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳上，使表型和基因型紧密地联系起来(图3)。由于编码外源短肤的简并密码子可指导合成全部20种氨基酸基1个终止子，从而使该肤库包含了该长度短肤的全部或绝大部分可能序列。由于线性噬菌体M13在噬菌体颗粒包装时对DNA的长度没有限制，所以由M13衍生出来的载体系统也能表达较大的蛋白分子，如单链抗体可变区(scFv)，生长激素(HGH)，胰蛋白酶(Trysin)等。噬菌体库可以非常庞大，如随机七肤库复杂度可达到大于1护克隆，利用固定于固相支持物(通常为玻璃珠、酶标板)的靶分子
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

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