应用四环素调控系统建立可调控抗恶性疟原虫DNA疫苗的初步研究

发布时间：2020-05-20 01:24

【摘要】：疫苗为人们所认识并开始应用已有200多年历史，现有的疫苗可分为四种类型，一是经过减毒处理但仍旧存活的病原体，一般称作减毒活疫苗；二是已经杀死的病原体，称作灭活疫苗；三是用病原体加工或利用基因工程技术得到的重组蛋白疫苗；还有一种是基因疫苗。自上世纪90年代初Wolff和Tang等报导了质粒DNA可以诱导针对编码抗原的免疫应答以来，DNA免疫接种已成为疫苗技术中发展最快的领域，这一全新的方法被认为是疫苗学最为重要的发现之一。1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。 核酸免疫最常用的载体是质粒DNA，借助其自身的启动子、终止子等以及宿主的转录翻译机制合成所编码的蛋白质分子。这种蛋白质较之在原核生物表达系统中产生的蛋白质更接近天然分子，，能够保持天然表位，可诱导机体产生体液免疫，也可产生细胞免疫，而且追加免疫可以加强免疫反应；很多病原体，如HIV、HBV、流感病毒及疟原虫红外期等的DNA疫苗已进入临床试验阶段。同时，DNA疫苗正在应用于肿瘤疫苗及其抗原T、B细胞表位的测定等。但DNA疫苗存在两个仍需解决的问题，一是对于DNA疫苗的免疫机制，仍有许多问题不完全清楚。二是DNA疫苗接种机体后，因其可长期表达，这有可能诱导免疫耐受等不良反应。 为尝试解决上述问题，本研究拟应用四环素(tetracycline,Tet)调控系统建立可调控的DNA免疫。首先构建了恶性疟原虫顶 第四军医大学硕士学位论文 端膜抗原1(AMA一1)基因和反式活化因子(tTA或rtTA)基因的 真核表达质粒pTL一8/灿认一l和PTL一8/灿认一1(rtTA)，并大量制 备这两种质粒及表达转录抑制子(tTS)的质粒pUHS6一1.以pTL一 8/AMA一1、pTL一8/灿认一l(rtTA)和pTL一8/灿认一1(rtTA)加 puHs6一1/tTS免疫小鼠后，用四环素类似物强力霉素 (doxyeyeline，dox)诱导或抑制上述DNA载体内AMA一1的表达， 并分离小鼠血清检测针对AMA一1抗体的诱导生成情况。pTL一 8/A拟一1和pTL一8八”A一1(rtTA)在没有被诱导表达时(仅基础 表达)，可诱导明显的免疫应答。在以PTL一8/劫认一l(rtTA)与 含tTs的pUHs6一共同免疫后，可极大地降低其免疫应答。应用 dox诱导pTL一8/AMA一1(rtTA)中的AMA一l基因表达后，又可引 起明显免疫应答. pTL一8/AMA一1(rtTA)附加 pUHS6一构成了可调控的DNA免 疫系统。该系统的建立将对进一步深入研究DNA疫苗的免疫机制 和调控基因表达、减少不良免疫反应以及进行可精确调控的基因 治疗打下一定的基础
【图文】：

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第四军医大学硕士学位论文e.再于50恻N洲2P0。、300耐NaeLPHS.0200001充分析，以上透析均在4℃进行;f.将透析袋中的溶液转人50oml锥形瓶中，加人0.smlNi一NTA，于4℃轻轻混悬1h;9.离心，弃去上清，用401加ffer洗涤两次伤。耐NaHZPo。300蒯Nael、20蒯imidazoiePHa.0矢h.再用0.501buffer占0恻NaHZPo。、300蒯Nael、2恻imidazolePHS.0)洗脱四次;i·Bradford法定量2.3.2结果图示分别为原核表达质粒pET-16b刀幼吸A一1在未诱导、诱导条下以及纯化后的SDS~PAGE。纯化后蛋白有少量降解的条带出现
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

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