人类反义CD40RNA真核表达载体的构建及其对B淋巴细胞功能的影响

发布时间：2020-05-29 22:43

【摘要】： 目的 构建反义CD40 RNA真核表达载体，转染健康人及SLE患者的B细胞系，鉴定其抑制B细胞CD40表达的能力，并研究B细胞在CD40被抑制以后增殖能力、抗体分泌的改变，开辟一条利用反义CD40 RNA抑制B淋巴细胞异常活化的途径，为研究B淋巴细胞功能异常所引起的自身免疫性疾病的发病机制及其治疗提供理论依据。 方法 从健康人外周血单个核细胞提取总RNA，利用RT-PCR扩增CD40部分序列，用T-A克隆技术形成PCR产物的克隆CD40／pUCm-T，并进行基因测序。根据测序结果，应用亚克隆技术反向接入真核表达载体pcDNA3，构建成目的基因片段／载体重组体-CD40／pcDNA3。双酶切法进行鉴定，并利用T7引物鉴定重组体CD40／pcDNA3的方向。以脂质体为介质瞬时转染健康人及SLE患者B细胞系，利用流式细胞技术检测膜CD40的表达情况，并利用MTT比色法检测细胞的增殖能力，，ELISA法检测培养液的Ig浓度，以研究B细胞在CD40被抑制以后增殖能力、抗体分泌的改变。 结果 1、人反义CD40 RNA真核表达载体经双酶切检验证明构建成功，T7引物证明CD40片段为反向插入。2、与转染pcDNA3空载体组或未转染质粒组相比较，转染CD40／pcDNA3的健康人及SLE患者B细胞系CD40的表达均明显减少，增殖能力明显下降，Ig的分泌受到明显抑制。 结论 成功构建了人反义CD40 RNA真核表达载体CD40／pcDNA3，此载体可有效的抑制健康人及SLE患者B细胞系CD40分子的表达，并抑制两者的增殖及抗体分泌。CD40基因在B细胞的生长代谢、抗体分泌中起着重要作用，反义RNA技术可作为一种有效的免疫调控手段。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392.1

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