人细小病毒B19中国株NS1蛋白基因全长的克隆及融合蛋白的表达

发布时间：2020-06-01 18:12

【摘要】： 目的细小病毒B19(Human Parvovirus B19，以下简称B19)，是已知的细小病毒属中唯一致人疾病的病毒。这一病毒广泛存在，在我国也有较高的感染率。主要通过呼吸道、血液制品和宫内传播。由于宿主的免疫力和血液学的状态不同，导致截然不同的临床表现：在健康儿童，导致无害的出疹性疾病，即感染性红斑；在成人，与一种急性多发性关节病有关；对于有潜在血液系统紊乱者，可诱发一过性的再障危象；对于免疫力抑制者，持续的病毒感染表现为再生障碍性贫血或慢性贫血；胎儿由于免疫力未成熟，更易感染B19，发生死胎、胎儿水肿和先天性贫血。B19病毒编码两个结构蛋白(VP1和VP2)及一个主要的非结构蛋白(NS1)。NS1有一个高度保守的核苷三磷酸结合构象，它对于一系列的生物学功能的发挥至关重要，在这一结构域中发生一个氨基酸突变时，NS1的细胞毒性即丧失，提示NS1与核苷三磷酸的结合在B19诱导的细胞凋亡过程中发挥重要的作用。NS1能提供第·军巨上膏硕士膏位公上 DNA结合位点，具有 Ah酶活性、核酸结合和翻译启动子功能。NS蛋白具有细胞毒性，能诱导细胞调亡。它的基因变异与病毒的致病力密切相关。 NS蛋白的细胞毒性与 caspase3通路诱发的细胞调亡密切相关。这一通路的激活在 NSI蛋白诱导的细胞凋亡中发挥重要的作用。而特异性 NS蛋白抗体可能与疾病的转归有关。Von Poblotzki等于 1995年成功构建了 NS蛋白大肠杆菌表达系统，，Hicks等于 1996年构建了 NS蛋白的杆状病毒 Hela细胞表达系统，这对于进一步研究 NSI蛋白的分于生物学活性提供了可能。研究的目的：扩增人细小病毒B19非结构蛋白Inysl）全长基因，构建克隆载体及原核表达载体，诱导表达 NSI融合蛋白。方法利用聚合酶链反应（PCR）和分子克隆技术，从我科保存的 BIg 阳性标本 XA20中扩增 NS蛋白基因全长，构建 NS IPGtu1七asy克隆载体，序列经测序分析证实正确后亚克隆于pQE30表达载体中，并转化至M15 感受态菌中，经IPTG诱导可表达77kD的融合蛋白。结果＊）扩增产物的测序结果与国外标准株（AU株）对比，有一处发生突变，第2439位碱基由T突变为C，氨基酸由精氨酸变为甲硫氨酸／2）构建了克隆载体NSI中GEM1七asy及原核表达载体 NSlpQE30，经酶切鉴定，证实载体构建成功。刀表达的NSI融合蛋白经 10％SDSPAGE电泳证实为 77kD。结论＊）建立了NSI－pQE30原核表达系统。NSI蛋白能在大肠杆菌中稳定表达，其条件是：阳性克隆菌增菌2～3 ／J＼时后，IPTG浓度 lmml／L，于 25”C诱导 3小时以上。（2在国内首次获得人细小病毒 B19 NSI蛋白融合表达产物，对进一步研究NSI蛋白的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要的意义。
【图文】：

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定和分析质粒，送上海申友生物工程公司测应用ABI100自动测序仪完成，经名为NSI一GEM一T一easy表达载体的构建与转化略选用的载体为pQE30，分子量3.4kb前有编码6个组氨酸标签的基因，2所示

载体,克隆及表达,位格,军医

第.军医大母硕士母位格文tctaaatccagtaaagagcaccaccagttatcgttagcacagtctagaacaaatagctccatgttaggatgttaaeaagtagt415图5:xA20一Nsl全长测序结果与标准株三、xA20一NSI全长的克隆及表达载体的酶切将挑取的阳性克隆经Bamhl、Pstl双Nsl一poEM一T一easy及原核表达载体NSI一pQE3oo，示四
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

【参考文献】