转化生长因子β1在动脉内膜损伤后狭窄形成中的作用

发布时间：2020-06-05 20:38

【摘要】： 研究背景冠心病是当前危害人类健康的最主要疾病之一。随着治疗水平的不断提高，冠心病的介入性治疗-经皮腔内冠状动脉成型术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)可以明显减轻病变血管的狭窄状况，改善缺血心肌的血供，已经成为与药物治疗、手术治疗同等重要的第三种治疗方法。PTCA的成功率可达95％以上，但约有35％～50％的病人在术后半年内出现原发部位的再狭窄(restenosis，RS)，严重影响了远期疗效。目前的研究表明，再狭窄的发生机制中一个最重要的环节是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在多种细胞因子的刺激下发生表型的改变、迁移、增殖并产生大量的细胞外基质。转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是一种相对分子量为2.5×10~4的二聚体多肽，具有调节细胞生长和分化的功能。研究表明TGF-β可以调节成纤维细胞和损伤血管VSMC增生，增加细胞间质的合成和分泌，增加细胞外基质和细胞骨架的结合。本课题以TGF-β_1为对象，研究其在血管损伤后狭窄过程中对胶原积聚、VSMC增殖、整合素-粘着斑激酶(FAK)蛋白表达的作用，以期对血管再狭窄的机理和防治进行进一步的探讨。研究目的 1．在已建立的内膜损伤后血管狭窄动物模型上，观察损伤后内膜增殖灶中TGF-β_1的表达及与Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的关系。观察TGF-β_1对体外培养的大鼠VSMC分泌胶原及MMPs活性的影响。以探讨TGF-β_1对细胞外基质积聚的作用。2．观察不同浓度的TGF-β_1刺激对体外培养的大鼠VSMC的增殖的影响。3．探讨TGF-β_1对整合素-FAK表达的作用。研究方法南京医科大学硕士学位论文 1.在已建立的腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上(新西兰大白兔21只，随机分为对照组和5组试验组，每组各3只，分别于腹一骼动脉联合损伤术术后l周、2周、4周、3个月及4个月处死)应用分子及免疫病理学的方法，用DIG标记的TGF一pl、I型胶原及MMP一9寡核普酸探针、m型胶原杭体，进行原位杂交和免疫组织化学实验，对TGF一p，、I、 m型胶原、MN[P一9的动态变化及相互关系进行探讨。 2.进行大鼠胸主动脉VSMC原代培养，并用免疫组织化学的方法通过抗鼠平滑肌细胞肌动蛋白(myosin)染色实验来鉴定培养细胞的性质。取 4一6代平滑肌细胞进行TGF一p:刺激，浓度为1 ng/ml、sng/ml、long/ml，作用时间为24小时，应用3H一脯氨酸(3H一Proline，3H一PRL)掺入法检测 VSMC分泌胶原的变化，并设立未加任何刺激的正常对照。同样刺激后，裂解细胞并收集细胞上清，用明胶酶谱法分别测定MMPs活性的改变。 3.取第4一6代VsMC行TGF一pl刺激，浓度为ing/ml、sng/ml、long/ml 作用时间为6小时，应用流式细胞仪测定并分析细胞DNA含量，用PCNA 免疚组织化学法和图像分析，观察TGF一p;对vsMc生长、增殖的影响。 4.在兔腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上用原位杂交的方法检测FAK mRNA的表达。同上经TGF一pl刺激6，J.时后，进行细胞免疫组织化学实验，，检测整合素av、FAK蛋白的表达变化，从而探讨TGF一pl 与整合素一FAK蛋白表达的关系。 5.原位杂交和免疫组化的结果以NYD一1 000型计算机图像分析系统分析。数据用5 PSS软件统计分析。研究结果 1.在已建立的兔腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上，观察了内膜损伤后4个月内狭窄处新生内膜中TGF一p，、I、In型胶原、MMP一9的动态变化。结果显示:内膜损伤后2周TGF一p，和I型胶原的表达开始增多，并逐渐增加至术后4个月。TGF一p，表达阳性细胞分布在增殖内膜及靠近内南京医科大学硕士学位论文膜的中膜，I型胶原阳性颗粒在第2周前主要位于增生细胞的胞装中，2周后主要位于间质。正常血管m型胶原mRNA的表达极低，损伤后1周迅速增加，至4周达到峰值。MMP一9的表达在术后2一4周时达到高峰，至4 个月表达有所下降，中期主要分布在新生内膜及中膜近外膜处，晚期(3- 4个月)主要位于弹力板周围。 2.进行了SD大鼠胸主动脉VSMC的原代培养，并对培养细胞的来源进行了免疫组织化学鉴定，证实为平滑肌细胞。通过’H一PRL掺入法检测经不同浓度的TGF一p，刺激24小时后胶原的合成:小剂量TGF一p，刺激对 vMSc分泌胶原影响不大，但随TGF一p:浓度增加，分泌胶原的量明显增多，与对照组比有显著性差异。MMPS活性检测结果表明，高浓度的TGF一pl 对MMP一2及MMP一9的活性有明显抑制作用。 3.PCNA免疫组织化学结果显示:经不同浓度的TGF一p，刺激6小时后，小剂量(Ing/ml)的TGF一p;即可以使平滑肌细胞PcNA的表达略有下降，且随着剂量的加大PCNA的阳性明显减弱，且阳性细胞只以弱阳性为主。流式细胞结果显示，随TGF一p:浓度加大，处于G夕GI的细胞比例逐渐增多，而处于S期的细胞比例逐渐减少。 4.FAK原位杂交结果显示:正常动脉在血管中膜有极少弱阳性表达，在内膜损伤后7天表达开始增加，并持续增多至术后4个月。应用不同浓度的TGF一pl刺激6，卜时后
【图文】：

血管中膜,蓝紫色,弹力,血管

J‘J.仗图1一1原位杂交阴性对照x400加汇吏图1一2正常血管:可见血管中膜有少量TGF一p;蓝紫色弱阳性颗粒，定位于细胞核，箭头所指为内弹力板。x40027

原位杂交,血管中膜,蓝紫色,弹力

原位杂交阴性对照x400
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R363

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