原肌球蛋白对血管平滑肌细胞游走能力影响的研究

发布时间：2020-06-14 19:40

【摘要】： 目的： 原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是肌肉收缩过程中的一种调节蛋白。本课题将基因重组的人平滑肌TM的同源体-β(hsmTM-β)表达于人冠状动脉平滑肌细胞(CASMC)中，旨在探讨TM对血管平滑肌细胞(VSMC)游走能力的影响，为探索平滑肌中原肌球蛋白的作用开辟新径。 方法与结果： 一．基因重组hsmTM-β 采用套式PCR技术，从人主动脉cDNA文库中扩增hsmTM-β的cDNA目的基因片段，用dGTP和T4 DNA聚合酶修饰；在逆转录病毒载体pLIB基础上正向插入AS-RI-Nru片段构建载体pLIB-AS，用限制性内切酶NruⅠ和EcoRI消化。目的基因和载体经酚氯仿抽提，盐乙醇沉淀纯化后，用GENECLEAN Turbo核酸纯化试剂盒从琼脂糖胶中提纯DNA，最后在DNA连接酶作用下，将hsmTM-β的cDNA反插入pLIB-AS中，获得重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β。用热休克法将重组DNA转化入感受态大肠杆菌XL10-Gold中，重组质粒按质粒的小规模制备的碱裂解法提取和纯化后，用限制性内切酶EcoRI验证其全长，用PCR方法验证其插入片段。结果显示用反插入法可以实现hsmTM-β的基因重组。借助DNA SIS软件分析人平滑肌TM和鸡平滑肌TM的cDNA核苷酸序列，发现二者同源性达84.7％。 二．hsmTM-β重组体的转染和表达 参照逆转录病毒基因的转染和表达使用手册，在DMEM和SmBM细胞培养液中分别培养人胚肾细胞(AmphoPack-293)和人冠状动脉平滑肌细胞(CASMC)至第三代，用CalPhos~(TM)哺乳类转染试剂盒，将hsmTM-β重组质粒pLIB-AS-hsmTM-β和含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA的重组质粒pLIB-EGFP分别转染进 AnlphoPack一293中，产生逆转录病毒，然后感染CAsMC使基因表达。用chariot 蛋白转染试剂盒将鸡胃平滑肌原肌球蛋白(gTM)转染进hsmTM一p/AS反义表达组 细胞中。蛋白表达用Westem Blot法检测。 三.WestemBlot分析 从CASMC中获取胞质蛋白，经12.5%SDS一AGE电泳后，将蛋白转至PDVF 膜上，用Westem blot法分析TM表达。PDV下膜用5%脱脂奶粉封闭液过夜后， 以兔抗原肌球蛋白多克隆抗体为一抗(l:1000)，抗兔免疫球蛋白抗体为二抗 (1: 5000)，结果显示以纯gTM为标准，与对照组和EGFP表达组相比，基因重组后 的hsmTM一p表达敲除。在hamTM一p/AS反义表达组细胞补充了gTM后表达平滑 肌原肌球蛋白(s mTM)，并随gTM蛋白转染量增多smTM表达增多。 四.VSMC游走测定 用Boyden’5 Ch田刀ber方法测定vSMC的游走，聚碳酸盐滤过膜使用前以 0.01%I型胶原包被。培养的CASMC细胞以2 xl护/ml的密度经胰蛋白酶消化后悬 于游走细胞培养液DMEM(含0.4%BSA)中。于Ch田刀ber的上室加感染不同质粒的 CASMC;下室加含有PDGF一BB和不含有PDGF一BB游走细胞培养液。将Chamber 移至二氧化碳孵箱中，37oC孵育5小时。随机选取四个400X高倍视野(4H卫F)内 游走细胞平均数评估细胞游走能力。 在PDGF一BB趋化剂刺激下，与对照组和EGFP表达组相比，单纯hsmTM一p/AS 反义表达组细胞游走能力明显增强(P005)。细胞的随机游走能力在hemTM一p基 因敲除时同样增强(P0.05)。在hsmTM一侧AS反义表达组细胞补充gTM之后， hsmTM一p基因敲除对细胞游走的刺激作用消失口0.05)。 结论 人平滑肌TM一p和鸡胃平滑肌TM一p的cDNA核昔酸序列的同源性达84.7%。 反插入法可实现hsmTM一p的基因重组，westem blot证实hsmTM基因敲除。 Boyden’s Chamber法测定平滑肌细胞游走，在PDGF一BB趋化剂下和细胞随机游走 下hsmTM一p基因敲除后CASMC的游走能力均增强。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R337
【图文】：

pLIB一AS经Eco砒消化产生117bp和47bp两个片段和164bP的未消化片断。若AS一班一Nru片段是反向插入pLIB中，将产生137bp和27bp两个片段，若AS一RI~Nru片段是正向插入pLIB中，产生的片断应与pLIB一AS的情况一致。如图1.4所示可见，样本2是筛选出的正向插入pLIB中的所要构建的pLIB一AS。PLIBpL田M一AS12345;::。争…，5.skb4.7kb嚼.留祥:岭州瓤图1.5示hsmTM一p重组体经限制性内切酶EcO人了切割在0.7%琼脂糖电泳上的结果。pLIB一s是对照，样本有10个。M是IKb的标准分子量。

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【引证文献】

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1 乌云娜;莎丽娜;格日勒图;;高压处理对牛骨骼肌原肌球蛋白结构的影响[J];食品工业科技;2012年03期

本文编号：2713260