STAT3在小鼠胚胎神经系统发育中的表达及与NTD的相关性研究

发布时间：2020-06-26 06:14

【摘要】：神经系统是机体最重要和最复杂的系统,它谜一样的发生过程一直吸引着发育神经生物学家的关注。而其中神经管的发生是关系到建立中枢神经系统(Central nervous system, CNS)原基的重要胚胎学事件,在这个过程中,神经板必须准时准确地关闭形成神经管,神经系统才能得以正常发育,否则将出现神经管缺陷(neural tube defect,NTD)和随之而来的脊柱裂或无脑等常见畸形。NTD的发病率在世界范围内占出生婴儿的0.1~0.9%,给家庭和社会带来了严重负担。但是迄今对此复杂过程的基因表达与确切调控途径均知之甚少,所以正常神经管形成的分子机制和NTD的发病机理已成为当今神经科学研究的热点和前沿。研究发现,胚胎9.5天(E9.5d)时,作为转录因子的信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription factor-3,STAT3)在早期胚胎发育中的脑区有较高水平的表达,而E9.5d正是神经管关闭的重要时期,这是否提示STAT3有可能参与神经管的关闭呢?它的表达异常是否和NTD的发生相关呢? 神经管闭合后,神经管上皮细胞的进一步增生、分化和迁移,它的前端呈现三个膨大,依次称为前脑泡、中脑泡和菱脑泡,前脑泡发育为端脑和间脑,中脑泡发育为中脑,菱脑泡的前部发育为后脑,以后演变为脑桥和小脑,菱脑泡的后部发育延髓,神经管尾端形成未来的脊髓。神经管上皮细胞的增生、分化和迁移对于神经系统正常结构和功能的建立十分重要。近年研究发现,有许多基因参与中枢神经系统发育的调控,外环境也是通过这些基因发挥作用的。作为转录因子的STAT3参与很多基因的表达和调控,并与其他转录因子形成复杂的调控网络。在胚胎神经系统尤其是神经上皮内检测到STAT3的表达,它是否可能通过启动不同靶基因表达来参与神经管上皮细胞的增生、分化和迁移呢? 研究提示,成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)参与调节早期神经发育阶段的许多关键过程,对鸡胚的研究发现FGF可能作为直接的神经诱导分子,其中FGF-8只在胚胎的早期增殖和神经发生阶段表达,涉及神经的早期发育和分化。已知FGFs是激活STAT的重要生长因子之一,并且FGF2与受体结合后可以激活STAT3, WP=10 由于FGF家族成员之间序列有高度的同源性,提示FGF8也可能激活STAT3而启动基因转录。FGF8是否可能作为STAT3上游的分子和STAT3共同促使神经管关闭呢?迄今对神经系统发育尤其是神经管关闭和NTD复杂过程的基因表达与调控的研究刚刚起步,涉及此过程的基因与具体调控途径均知之甚少,目前对正常神经管形成和NTD发生过程中的信号转导通路及分子机制的研究也尚无明确定论。本实验采用全胚胎原位杂交技术、免疫组织化学技术、免疫细胞荧光染色技术等方法,观察到了STAT3在胚胎发育中时空表达规律,尤其在神经胚形成阶段和神经上皮增生、分化和迁移中的表达变化规律;并利用喂服过量维甲酸(retinoic acid, RA)诱导NTD模型,观察发生NTD的胚胎STAT3的表达变化;同时采用全胚胎原位杂交技术观察FGF8在正常胚胎神经胚形成(neurulation)过程中的表达和在NTD中的表达变化,并比较了FGF8和STAT3变化规律及其关系,旨在探讨STAT3在正常神经上皮发育及神经管关闭过程中的作用,试图揭示STAT3信号转导通路在胚胎神经系统发育过程中的作用和可能的分子机制。结果如下: 一、STAT3在小鼠胚胎神经系统发育中的表达 1、采用全胚胎原位杂交技术可观察到E8.75~11.5d小鼠胚胎STAT3的表达情况,在E8.75d时整个鼠胚几乎没有观察到STAT3 mRNA的表达,在E9.5d,随着神经管的逐渐关闭,STAT3 mRNA在前脑泡急剧增多,到E10.5d,阳性信号由前脑泡转移至中脑泡,E11.5d时仅在后脑泡的一狭窄区域检测到STAT3 mRNA的表达。STAT3胚胎神经组织的表达,尤其是神经管头段STAT3的表达及其时空变化,提示STAT3有可能参与了这个时期神经管的关闭以及神经管头段的发育。 2、本实验用酶免疫组织化学方法观察到在E13.5d,在侧脑室周围即未来大脑新皮层区域、间脑、发育中的视网膜、第四脑室周围的脑组织(未来的脑桥)、脊髓、三叉神经节和背根神经节C1均可观察到较强的STAT3阳性信号。E13d正是神经上皮套层细胞开始向边缘层迁移的时候,此时各脑区大量细胞表达STAT3,提示STAT3可能参与了神经前体细胞的分化和迁移。用荧光免疫组织化学方法观察,E14.5d和E15.5d时,大脑皮层、间脑、视网膜、第四脑室周围以及发育中的脑桥和脊髓等部位均可观察到发中等强度荧光的细胞,提示在细胞基本完成迁移和分化后,STAT3的表达有所下降。二、STAT3与RA致小鼠NTD的关系 1、与正常对照组相比,喂服RA后孕鼠在E9.5~10.5d可观察到前脑顶部和后脑未闭合的畸形胚胎,在少数胚胎可观察到整个神经管未闭合,呈开放状态。表明该剂量的RA可以造成CNS发育的缺陷。 WP=11 2、采用全胚胎原位杂交技术可以观察到RA诱导所致NTD畸形的鼠胚STAT3表达变化的情况,在E9.5、10.5d时 STAT3 mRNA的表达较正常胚胎减少,在前脑泡和中脑泡未观察到明显的STAT3 mRNA表达;E11.5d的胚胎神经管已关闭,与正常鼠胚相比STAT3 mRNA的表达无明显变化。研究发现,STAT3分子可以启动一些促进细胞存活的基因转录,如Bcl-2和Bcl-XL,从而维持细胞的存活。NTD发生时伴有的STAT3表达下调,这可
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329
【图文】：

氨基酸序列,电泳图,产物,核酸探针

STAT3 和 FGF8cRNA 核酸探针的制备STAT3cRNA 核酸探针的制备钙法转化含 STAT3 全长的质粒，碱裂解法抽提质粒，应用生物软件族成员的核酸和氨基酸序列，选取开放阅读框 133~720bp 的片段作 primer primier 5 软件设计引物，并在引物的 5’端分别加入 RNA 聚 SP6，交公司合成引物，以质粒为模板进行 PCR，合成长度为 431bT7 和 SP6 的片段，经胶回收试剂盒纯化(见图 1-1)；以此片段为模板剂盒进行探针标记，经检测探针含量符合要求。FGF8cRNA 核酸探针的制备钙法转化含 FGF8 全长的质粒，碱裂解法抽提质粒，因质粒上携带有子 T7 和 T3，用限制性内切酶 PstI 将 800bp 的插入片段在 450bp 处化，经胶回收试剂盒纯化(见图 1-1)；以此片段为模板应用地高辛标标记，经检测探针含量符合要求。

原位杂交

E10.5d全胚胎原位杂交示STAT3mRNA(×20)

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