人源抗BLyS单链抗体的筛

发布时间：2020-08-21 13:36

【摘要】：B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stilmulator, BLyS)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族成员之一,其主要由单核细胞和巨噬细胞产生。BLyS对于B淋巴细胞的生长、分化、增殖和凋亡有着非常重要的影响。BLyS的过表达与多种人类自身性免疫疾病有关,如类风湿性关节炎,重症肌无力,系统性红斑狼疮等。尤其是系统性红斑狼疮的发生、发展等一系列过程都与BLyS有着极其密切的关系。因此阻断BLyS信号通路成为治疗这类疾病行之有效的思路和方法,而针对BLyS这一靶点开发出的单克隆抗体药物贝利木单抗在SLE的治疗上起到了非常好的效果。比起全长抗体,单链抗体(single-chain fragment variable, ScFv)有着其独到的优势：既能特异性地结合抗原,又不与含有Fc受体的细胞结合。由于其分子量只有全长抗体的1/6,更易于穿透组织到达靶部位。因此抗BLyS单链抗体在自身性免疫疾病上具有潜在的治疗价值和广阔的应用前景。利用哺乳动物细胞抗体库筛选抗体是近些年来发展起来的较为新颖的抗体库筛选技术。其主要依托于哺乳动物细胞,将抗体的筛选直接移植到真核表达体系上来,这样就解决了原核表达系统不具备蛋白翻译后修饰的难题,使得表达的蛋白最接近天然的人源抗体。在本课题中,我们主要利用哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库来筛选全新的、具有较高亲和力的抗BLyS单链抗体,构建、表达抗BLyS单链抗体并对其活性进行初步的鉴定。第一部分利用哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库筛选抗BLyS ScFv本部分的研究目的主要是利用哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库筛选抗BLyS ScFv。首先将抗体库转染至293T细胞中,使库中的ScFv表达在细胞膜表面,然后以经FITC标记的BLyS抗原进行共孵育,以流式细胞仪筛选出荧光强度最强、占细胞总数1%的细胞。提取并收集质粒,作为下一轮筛选的质粒库。通过三轮筛选、每轮梯度降低抗原的浓度(1 μg/106cells-0.1 μg/106cells-0.01 μg/106cells)从而筛选出亲和力较强的人源抗BLyS单链抗体。通过测序来获得ScFv序列,并在IgBlast和IMGT上对获得的ScFv序列进行比对和分析。可见,在本部分研究中,我们成功通过筛选获得了两个全新的人源抗BLyS的ScFv序列,这些序列中的VH与VL都有着正确的骨架区和互补决定区并且是有功能的。第二部分人源抗BLyS单链抗体的构建、表达及其初步活性鉴定本部分的研究目的主要是将获得的ScFv序列整合进真核表达载体p3457-his中构建重组质粒,表达、获得ScFv抗体并对其活性进行初定鉴定。我们利用基因重组技术,通过PCR扩增,酶切、酶连以及转化获得重组质粒,以菌液PCR、基因测序、质粒电泳和酶切等方法对重组质粒进行鉴定,并将两种重组质粒分别命名为p3457 B6-ScFv和p3457 B10-ScFv;将两种重组质粒分别瞬时转染293E细胞中,悬浮培养6-7 d后收取细胞上清,以SDS-PSGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况,在特定处出现有目的条带；目的蛋白纯化后以western blot检测其纯化情况；以BCA(bicinchoninic acid disodium)方法来对纯化的蛋白进行定量；以ForteBio Octet QK鉴定B-6 ScFv和B-10 ScFv的体外结合活性并测定两者亲和力常数；在受体结合阻断实验中,我们将膜表达BLyS两种受体(TACI和BAFFR)的质粒瞬时转染293T细胞,培养48 h后分别与FITC-BLyS, FITC-BLyS+ScFv和等体积的PBS共孵育1 h,以流式细胞仪检测细胞的迁移情况。结果显示与FITC-BLyS+ScFv共孵育的细胞群其迁移程度明显要弱于与FITC-BLyS共孵育的细胞群。至此,在本部分研究中,我们成功构建了两种重组质粒并成功表达了相应的抗体蛋白B-6 ScFv和B-10 ScFv,亲和力测定显示两者的亲和力常数分别为10 nM和3.08 nM,表明两种单链抗体的亲和力较高；两者均能特异性结合BLyS抗原,显示其具有一定的体外结合活性和受体阻断活性。综上所述,本研究成功利用哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库筛选出了两个全新的抗BLyS ScFv抗体及其序列并成功表达出了两种亲和力较高且有一定体外活性的人源抗BLyS单链抗体。本研究工作为后续进一步的研究奠定了基础,并且为针对其他靶点的人源ScFv筛选提供了思路和方法。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392

【参考文献】