模拟糖尿病并发抑郁症环境下海马区神经血管单元体外模型的建立及中药干预

发布时间：2020-08-24 11:36

【摘要】：目的:1.通过葡萄糖联合皮质酮干预由NE、AS、BM组成的海马区神经血管单元,建立模拟DD环境下体外海马区NVU模型,并从细胞形态、屏障功能、基础结构、分泌功能多角度建立模型评价体系。2.以模拟DD环境下海马区NVU体外模型为研究对象,给予中药复方左归降糖解郁方干预,明确其对模拟DD环境下海马区NVU体外模型的保护作用的机制,为DD的防治提供新思路。方法:1.模拟DD环境下海马区NVU模型的建立。分离并纯化的NE、AS、BM细胞建立NE+AS、AS+BM、NE+AS+BM三个正常对照组及NE+AS+GP、AS+BM+GP、NE+AS+BM+GP三个模型对照组。在本课题组前期工作基础上改进其实验方法,采用葡萄糖(150mmol/L)及皮质酮(200μmol/L)干预18h,(1)细胞形态评价:倒置相差显微镜下观察各组细胞生长状态;(2)屏障功能评价:细胞电阻仪测跨内皮细胞电阻值、4 h渗漏试验;(3)基础结构评价:Western-blotting方法检测BM结构蛋白Occluding、AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表达;(4)分泌功能评价:ELISA法检测BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法检测神经递质5-HT含量、流式细胞术(FCM)检测各组海马神经元的凋亡情况。2.左归降糖解郁方对模拟DD环境下海马区NVU模型的保护作用。采用方法1建立模拟DD环境下海马区NVU模型,并随机分为正常对照组、正常+空白血清组、模拟DD环境下海马区NVU模型组(模型组)、模型+(二甲双胍+氟西汀)含药血清组、模型+左归降糖解郁方含药血清组5组。除正常对照组及正常+空白血清组外其它三组造模给药18h后,(1)细胞形态评价:倒置相差显微镜下观察各组细胞生长状态;(2)屏障功能评价:细胞电阻仪测跨内皮细胞电阻值、4 h渗漏试验;(3)基础结构评价:Western-blotting方法检测BM结构蛋白Occluding、AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP蛋白的表达;(4)分泌功能评价:ELISA法检测BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量、ELISA法检测神经递质5-HT含量、流式细胞术(FCM)检测各组海马神经元的凋亡情况。结果:1.与正常对照组比较,葡萄糖联合及皮质酮两细胞或三细胞模型组培养体系中NE、AS、BM细胞生长状态明显变差;跨内皮细胞电阻值显著降低,4h渗漏试验液面差显著增大(P0.05);AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM紧密连接蛋白occluding的表达明显降低(P0.05);细胞内及细胞上清液5-HT含量明显降低(P0.05);BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量显著降低(P0.05);海马神经元凋亡率升高(P0.05)。2.与正常对照组及正常血清比较,模型组各项指标均出现明显异常。与模型组比较,左归降糖解郁方含药血清组生长状态明显变好;跨内皮细胞电阻值显著升高,4h渗漏试验液面差显著减小(P0.05);AS缝隙连接蛋白CX43及骨架蛋白GFAP和BM紧密连接蛋白occluding的表达明显增加(P0.05)。BM分泌蛋白LIF及AS分泌蛋白TGF-β1、GDNF、bFGF、ANG1的含量显著升高(P0.05);细胞内及细胞上清液5-HT含量明显升高(P0.05);海马神经元凋亡率降低(P0.05)。结论:1.结合本课题组前期研究与本实验结果,选择葡萄糖(150 mmol/L)及皮质酮(200μmol/L)进行干预;结合DD临床特征及神经血管单元生理作用,采用形态学、结构、功能等多角度指标建立一套模拟DD环境下海马区NVU体外模型的评价指标。2.模拟DD环境下海马区NVU体外模型其细胞形态、屏障功能、基础结构、分泌功能的损伤,这可能是DD发生发展的病理机制。3.左归降糖解郁方可改善海马区NVU各组成细胞的生长状态,调节神经递质分泌紊乱,改善海马区NVU屏障功能,提高海马区NVU功能相关分泌蛋白LIF、TGF-β、GDNF、bFGF、ANG1表达,升高海马神经元细胞存活率,对模拟DD环境下海马区NVU体外模型有一定改善作用,值得进一步研究和开发。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

图 1.1 NE、AS、BM 三种细胞单独培养及鉴定（400×）A. NE 原代培养 5d B. NSE 荧光鉴定 C. AS 第二代培养D. GFAP 荧光鉴定 E. BM 第二代培养 5d F.CD31 荧光鉴定拟 DD 环境下海马区 NVU 的形态观察相差显微镜下，对正常共培养海马区 NVU 及高糖联合皮质酮造模VU进行形态学观察。模型（NE+AS+G&P）（AS+BM+G&P）（NVU+正常（NE+AS）（AS+BM）（NE+AS+BM）组比较，神经元轴突断裂，星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞胞体颗粒状增多，折光率增多。模型组内，（NVU+G&P）对照组与（NE+AS+G&P）（AS+BM+较，共培养早期海马神经元差异镜下观察无太大差异，共培养，海马神经元细胞碎片较少，神经网络丰富度较高，星形胶质细胞

图 1.2 模拟 DD 环境下海马区 NVU 模型中 NE 的生长状态（100×）A. NE+AS 组 B. NVU 组 C. NE+AS+G&P 组 D. NVU+G&P 组图 1.3 模拟 DD 环境下海马区 NVU 模型中 AS 的生长状态（100×）

皮质酮对海马区 NVU 形态有损伤作用。图 1.2 模拟 DD 环境下海马区 NVU 模型中 NE 的生长状态（100×）A. NE+AS 组 B. NVU 组 C. NE+AS+G&P 组 D. NVU+G&P 组

【参考文献】

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本文编号：2802418