肝细胞生长因子诱导细胞增殖和迁移的机制研究

发布时间：2020-10-17 09:26

　　 肝细胞生长因子是一种作用广泛的细胞因子，对多种组织细胞具有重要的调控作用，包括刺激细胞增殖，促进细胞迁移及抑制细胞凋亡等。HGF的生物学效应通过不同的信号途径介导。鞘氨醇-1-磷酸盐(S1P)是质膜鞘磷脂的代谢产物，也是重要的生物活性物质，可调节细胞的增殖、迁移、分化、死亡等。鞘氨醇激酶(SK)是S1P合成的关键酶，目前被证明是一重要的信号分子。但是，SK是否参与HGF的信号转导及介导HGF的生物学效应并不清楚。本研究利用肝癌细胞系HepG2及SMMC-7721为模型，观察了HGF与SK信号之间的关系。 我们采用RT-PCR和免疫组化的方法，从基因和蛋白水平分析了HGF受体c-Met、SK及S1P受体EDG-1、EDG-3、EDG-5在HepG2和SMMC-7721细胞的表达情况。这两个细胞系高表达上述分子，因此是研究HGF和SK通路的理想靶细胞。我们利用MTT法和细胞迁移测试法观察到重组HGF对肝癌细胞只有轻度的刺激增殖作用，但却有很强的促迁移作用。我们建立了[γ_~(32)P]ATP掺入检测细胞内SK活性的方法。HGF作用于SMMC-7721细胞后能明显增强细胞内SK的活性。已知HGF／c-Met可以激活PI-3K、Rho和MAPK信号通路。PI-3K和MAPK的特异性阻断剂Ly294002、PD98059可以阻断HGF对SK的激活作用，表明HGF／c-Met通过MAPK、PI-3K途径来激活SK，SK是MAPK、PI-3K的下游分子。 为探讨SK是否介导HGF的生物学效应，我们采用二甲基鞘氨醇(DMS)阻断SK通路，结果发现抑制SK酶的活性可以明显阻断HGF对细胞的刺激增殖与迁移作用。另外，PI-3K抑制剂Ly294002，MAPK信号通路阻断剂PD98059具有和DMS类似的效果，而Rho信号通路抑制剂Y27632则对细胞的增殖和迁移无影响。这些结果表明HGF／c-Met通过PI-3K和MAPK激活SK，SK参与HGF诱导的促肝癌细胞增殖和迁移作用。 在上述信号通路研究基础上，我们建立了不依赖于配体的化学激活c-Met受体的模型，从人骨髓间充质干细胞中克隆了c-met基因的胞内区，经测序鉴定正确后，构建与FKBP相连的融合基因表达载体。分别通过脂质体和磷酸钙的方法转染 硕士学位论文:摘要 Mo7e、SMMC一7721细胞，利用RpPCR和W七stern Blot的方法检测到细胞株稳 定表达该基因。用FKBP的结合药物APZO 1 87刺激稳定表达融合基因的 SMMC一7721细胞系，发现AP加1 87能够激活胞内SK活性，和HGF的激活作用 类似，说明AP20187可以激活c一Mct信号通路。该模型为深入研究细胞信号途径， 阐明c一met在肿瘤发生和发展过程中的作用及在诱导多能干细胞向肝细胞分化中 的作用提供了实验基础，为研究孤儿受体的功能提供了技术平台。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R363
【部分图文】：

1.1HepGZ、7721细胞RNAo.醛变性琼脂糖凝胶电泳图RNA的方法提取SMMC一7总RNA的OD26o/ODZsoL光度计测OD26o/ODZso比1、859林g/ml、793林留ml，电泳显示，总RNA的28S常，验证了总RNA的完整序列设计了特异性扩增c一cDNA，以此作为模板利A各2陀进行RFPCRc一et奋，

断剂对HGF的迁移阻断作用。采用信号通路抑制剂预处理细胞后，进行HGF的促迁移实验，光学显微镜下观察结果如图1.13，A:conirol;B为HGF组;C为PD98059+HGF组;D为LY294002+HGF组;E为DMS+HGF组。图1.14为每组各随机挑选三个视野计数迁移细胞。由图可看出，应用三种阻断剂后，HGF的促迁移作用被阻断，其中阻断作用最明显的是DMS。综上说明SK参与了HGF的促增殖、迁移效应，且在其中起重要作用。

EeoRI、BamHI切后连接ECORIBamHI图2.2PI一ZFv载体构建示意图示，用Eeo租、BamHI酶将2XFKBpv基因片段，定向克隆到表达载体PIRESneo上，命名为Pl一对PI一ZFv质粒进行酶切鉴定:AM
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本文编号：2844596