MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-10-18 02:33

　　 目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50～2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%～111.9%之间,变异系数均10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。
【部分图文】：

7］，分别利用12%SDS-PAGE和Westernblot分析抗体纯度及特异性。通过Lowry法测定抗体浓度并根据HＲP-抗体标记试剂盒说明书要求进行抗体标记。1．6双抗体夹心ELISA的建立用纯化的兔抗体作为包被抗体，5%人血白蛋白为封闭液，HＲP标记羊抗兔抗体作为二抗，建立双抗体夹心ELISA基本方法，进一步研究不同包被抗体质量浓度(5、10、20和40μg/mL)、二抗的工作浓度(1∶500、1∶1000、1∶2000和1∶4000)等条件下的HCP浓度和A450nm值的相关性，按照图1操作，以确定适宜的工作条件。图1双抗体夹心ELISA检测方法流程图Fig．1TheflowchartfordoubleantibodysandwichELISAdetection1．7方法的验证1．7．1线性范围将MDCK细胞蛋白抗原参考品作系列稀释至50～2500ng/mL，用建立的双抗体夹心ELISA进行检测，进行3次重复，以MDCK细胞HCP质量浓度(ng/mL)为横坐标，A450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，确定线性范围与检测限。1．7．2特异性验证按照MDCK细胞HCP制备方法来制备Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞HCP，用建立的双抗体夹心ELISA检测并分析此方法的特异性。1．7．3准确度、精密性与重复性验证将MDCK细胞HCP抗原参考品分别稀释至1000、500和250ng/mL，用建立的双抗体夹心ELISA在不同的时间重复测定8～10次，计算检测回收率及变异系数，验证该方法的准确度与重复性。1．8方法在基于MDCK培养的流感疫苗纯化工艺中的适用性收集甲型H7N9流感病毒接种MDCK细胞后的细胞上清收获液和经澄清、超滤、两步层析后进一步超滤透

氖视眯?收集甲型H7N9流感病毒接种MDCK细胞后的细胞上清收获液和经澄清、超滤、两步层析后进一步超滤透析的样品，用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化。1．9统计学分析用Excel2010软件对实验数据建立数据库，并生成标准曲线和回归方程。用SPSS16．0软件进行统计学分析，计量资料以(x珋±SD)表示，对重复性检测数据进行方差分析和LSD检验，P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1MDCK细胞蛋白抗原及参考品制备制备的3批MDCK细胞蛋白电泳分析见图2，蛋白质量浓度为1μg/mL。稀释分装保存，用于后续新西兰兔的免疫，同时作为HCP参考品，参考品质量浓度为0．2μg/mL。注:M．Marker;1～3．制备的3批MDCK细胞蛋白。图2制备的MDCK细胞HCPSDS-PAGE分析Fig．2AnalysisoftotalproteinextractspreparedfromMDCKcellbySDS-PAGE微生物学免疫学进展2019年8月第47卷第4期ProginMicrobiolImmunol，Aug．2019，Vol．47No．4·3·

2．2MDCK细胞蛋白兔多克隆抗体制备、纯化与标记将MDCK细胞HCP辅以弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂免疫新西兰兔后可诱导良好的抗体反应，且随着免疫次数的增加兔血清抗体滴度呈增长趋势，经4次加强免疫后，兔血清抗体滴度可达到1∶8000，见图3。图3新西兰兔经不同次数免疫后针对MDCK细胞蛋白的血清抗体反应情况Fig．3ＲabbitantibodyresponsesagainstMDCKcellproteininimmunizationprocess血清抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法和ProteinA亲和层析后，利用SDS-PAGE分析，其纯度可达到95%，见图4。进一步利用Westernblot分析，显示纯注:M．Marker;1．纯化兔抗MDCK细胞HCP抗体还原SDS-PAGE;2．纯化兔抗MDCK细胞HCP抗体非还原SDS-PAGE。图4纯化兔抗MDCK细胞HCP抗体SDS-PAGEFig．4AnalysisofpurifiedrabibitantibodiesagainstMDCKcellHCPbySDS-PAGE化的抗体可与MDCK细胞HCP特异性结合并具有较好的覆盖率，见图5。注:M．Marker;1．纯化兔抗MDCK细胞HCP抗体。图5纯化兔抗MDCK细胞HCP抗体Westernblot分析Fig．5AnalysisofpurifiedrabibitantibodiesagainstMDCKcellHCPbyWesternblot2．3双抗体夹心ELISA的建立2．3．1包板抗体浓度确定结果显示，在包板质量浓度为10μg/mL时，HCP质量浓度和A450nm值有较高的线性相关性，Ｒ2=0．9940，见图6。2．3．2检测抗体稀释度确定结果显示，HＲP标记抗体的稀释度为1∶500时标准曲线线性关系良好，Ｒ2=0．9908，因此将1∶500确定为HＲP标记抗体最佳工作浓度，见图7。2．4方法的验证2．4?
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