突变型白细胞介素-2的表达、纯化及生物学活性测定

发布时间：2020-10-19 12:25

　　 白细胞介素－2（IL-2）最初曾为称为T细胞生长因子，并能促使各种造血细胞增殖和分化。临床研究表明其关键作用可作为T淋巴细胞激活的增殖信号，因而将IL-2用于治疗艾滋病。基于其能刺激具有细胞毒的，抗肿瘤细胞的能力，IL-2还用于各种癌症的治疗。目前人IL-2已经完全用基因工程的方法生产，而且基因工程IL-2与天然IL-2的功能和临床效果基本一致。 目的：近年来，虽然基因工程IL-2应用于肝炎及某些癌症的治疗已取得令人属目的成果，但大计量，长时间用药对病人仍然存在一定的副作用，如发热、寒战、恶心、呕吐、头晕、乏力和毛细血管渗漏综合症等，所以，为了提高人重组白细胞介素－2的稳定性和活性以及减少毒副作用，有必要定向改造rhIL－2的分子结构，并在毕赤酵母中高效表达hIL-2cDNA，获得hIL-2蛋白，拟对野生型hIL-2进行结构改造以获得新的突变体，同时进行活性测定，以便深入了解hIL-2的结构与功能的关系。方法：用PCR法从白细胞介素-2cDNA全序列中扩增成熟的肽基因片段，并利用定点突变技术将人重组白细胞介素－2第125位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列；编码18位亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列；编码19位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列，经限制酶片段分析与DNA序列分析证明后，获得突变体MvhIL-2。IL-2基因片段与酵母中间载体pPIC9K融合后，转化到大肠杆菌TOP10F',扩增质粒，获得大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再转化毕赤酵母，并在摇瓶和发酵罐上对IL-2-C125A/L18M/L19S进行了表达。然后，利用离子交换层析的方法纯化了MvhIL-2蛋白，利用IL-2依赖细胞株CTLL－2细胞对纯化的突变蛋白（IL-2-C125A/L18M/L19S）和野生型IL-2（同样方法获得的）进行测活。结果：本实验成功地构建IL-2突变体，并在毕赤酵母中得到表达。将pPIC9K-MvhIL-2DNA用酶切后，转入真核表达系统－毕赤酵母得到的转化子经摇瓶和发酵罐发酵，上清液用15％SDS-PAGE检测表明有IL-2突变体的表达；经Western-blot和ELISA检测有免疫活性。经超滤浓缩，强阴离子交换Q柱层析得到纯化的突变型人IL-2。纯化的突变蛋白对CTLL-2细胞有刺激性；与野生型IL-2相比，在各种温度条件下储存的突变蛋白保留有更高的活性；pPIC9KMvhIL-2整合到毕赤酵母中表达量占菌体总蛋白的30％以上，高表达得到的IL-2具有高活性。结论人IL-2cDNA可通过PCR技术进行定点突变，所获得的突变型MvhIL-2活性比天然型MvhIL-2高4－5倍。所以IL-2突变体（IL-2-C125A/L18M/L18S）较野 WP=5 生型的IL-2具有更高的稳定性和活性。
【学位单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 绪论
    1.1 引言
    1.2 基因工程药物生产的基本过程
    1.3 本文的主要研究内容
        1.3.1 国内外研究概况及开发突变型IL-2的必要性
        1.3.2 人IL-2的结构及理化性质
        1.3.3 IL-2R及其基因结构
        1.3.4 IL-2生物学活性与IL-2R的相互关系
    1.4 本文的创新之处
        1.4.1 IL-2三突变位点的设计思想
        1.4.2 用巴斯德毕赤酵母系统（Pichia Pastoris）表达IL-2和变异IL-2
        1.4.3 建立一种简单方便、且有效的Pichia Pastoris的直接诱导表达方法
        1.4.4 建立一套用Pichia Pastoris分泌表达的变异IL-2并利于工业化生产的纯化工艺
2 克隆、表达及其纯化
    2.1 材料与方法
        2.1.1 细胞株与质粒
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 突变型白细胞介素-2工程菌发酵
        2.1.4. ①工程菌摇瓶条件下的发酵
        2.1.4. ②转化子的高密度发酵
        2.1.5 突变型白细胞介素－2的纯化
        2.1.6 突变型白细胞介素-2（IL-2）蛋白的抗原性检测
        2.1.7 突变型白细胞介素-2生物活性的测定
        2.1.7 白细胞介素-2蛋的ELISA（免疫酶标技术）检测
3 结果
    3.1 工程菌摇瓶条件下的发酵
        3.1.1 直接诱导法和转换培养基诱导法表达蛋白的结果
        3.1.2 碳源对转化子生长的影响
        3.1.3 温度对突变型IL-2表达的影响
        3.1.5 摇瓶转速对突变型IL-2表达的影响
600对突变型白细胞介素－2蛋白表达的影响'>        3.1.6 不同OD₆₀₀对突变型白细胞介素－2蛋白表达的影响
    3.2 转化子的高密度发酵
    3.3 突变型白细胞介素－2的纯化
    3.4 突变型白细胞介素－2蛋白抗原性检测
    3.5 MTT法活性测定的结果
4 讨论
    4.1 较直接诱导法和传统诱导法的比较
    4.2 毕赤酵母分泌型发酵产物纯化和大肠杆菌包涵体产物的纯化的比较
    4.3 野生型IL－2蛋白同突变IL－2蛋白的性质比较
5 结论
参考文献
致谢
附录：攻硕期间论文发表及参加科研项目情况

【参考文献】

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1 虞建良,范佩芳,郑宏大,孙兰英,王子轩,郑仲承,李伯良,陈寅,唐建伟,刘新垣;人白细胞介素-2在大肠杆菌高效表达及其纯化与鉴定[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1995年10期

2 蒋春雷,徐荻,周月芳,郑仲承,刘新垣,宋朝佑,路长林;人白细胞介素-2结构与镇痛功能关系的研究[J];中国科学C辑:生命科学;1996年01期

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4 于忠国,刘东升,张智清;突变型人重组IL-2的研制[J];中华微生物学和免疫学杂志;1995年03期

本文编号：2847194