乙型肝炎病毒EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合蛋白的研究

发布时间：2021-01-09 03:51

　　目的：研究与HBV的调控基因EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ结合的肝细胞特异性蛋白质因子，以进一步了解HBV嗜肝性的分子生物学机制，为探索特异性更强的基因治疗技术奠定基础及进一步的治疗应用创造条件。 方法：（1）应用噬菌体表面展示技术分别以生物素化的HBV增强子Ⅰ（EnhⅠ）、HBV表面抗原启动子Ⅰ（SPⅠ）、HBV表面抗原启动子Ⅱ（SPⅡ）PCR产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”过程，经噬斑的PCR扩增后，构建T-A克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索，确定EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ DNA结合蛋白。（2）将筛选到的HBV SPⅡ结合蛋白之一的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基4（NADHDH4），根据其全基因编码序列，设计引物，以人肝癌细胞基因组为模板，经PCR得到NADHDH4的全基因编码序列，将其构建到真核表达载体pcDNA3.1（-）中。将HBV SPⅡ启动子构建到氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因载体中，二者共转染人肝癌细胞系HepG2，用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达。 结果：（1）噬菌体经... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

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【学位级别】：硕士

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Lane:200aer部分阳性噬斑裂解液PCR扩增Lanel一5:第4阳噬裂PCR果

一一一一一一一一一一一一兰翌遐盆_确，DNA片段大小为138bP。成功扩增了HBvsPI启动子DNA片段。(结果见图2一l)1234567892000bP-~138bP图2一1HBVSPIPCR扩增Lanel:2000bPmarker;LaneZ一9:SPIPCR结果2.肝细胞cDNA文库的筛选以固相化的SPI启动子DNA片段作为支持分子，对肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附一洗脱一扩增”的筛选。噬菌体的富集结果见表2一1。从固相平板洗脱的噬菌体数显示了明显的增加趋势，第4轮与第1轮相比，富集了356倍(富集倍数=第4轮产出率/第1轮产出率)。表2一l亲和筛选对噬菌体的富集筛选次数噬菌体数投入产出率捕获第1轮第2轮第3轮第4轮3.5xl082.5x10112.6x10151.sx10202.sxloll2.6x10151.sxl02o3.sx10257.1x1021.ox1045.8x1042.5xl05注:产出率=捕获的噬菌体数量/投入的噬菌体数量3.目的基因的PCR扩增经过4轮筛选，随机挑取14个阳性噬斑为模板，用T7selectPcR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。结果产生片段大小不等的条带(图2一2)，裂解液重复PCR得到相同结果。.PCR扩增，用同一噬斑引

第三军医大学硕士学位论文M2000123456782000bP-250bP-图2-2LaneM:2000盯拐Ifker阳性噬斑裂解液PCR扩增Lanel一8:第4轮阳性噬斑裂解液PCR4.序列比对和同源性分析对阳性克隆基因的DNA序列测定，及根据GenBank数据库提供的数据进行BLASTn同源性搜索，8个阳性克隆筛选到启动子DNA结合蛋白，共编码7种蛋白。其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4一氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白，结果见表2一2。表2一2应用噬菌体展示技术筛选到的阳性克隆编号同源性99%100%99%99%100%100%100%克隆数编码蛋白isolate183而toehondrion(孤立线粒体183)RF~C/aetivator1homolog(释放因子C/激活因子l同源体)hypothetiealproteinMGC9515(人类假想蛋白MGC9515)Haptoglobin(触珠蛋白)4一a而nobutyratea而notransferase(4一氨基T酸氨基转移酶)ehromosome3eloneRPll一801L18(复制蛋白11一80lL18)hypothetiealproteinFI日22056(人类假想蛋白日J22056)讨论噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术，基本原理及操作过程为:以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，如在噬菌体蛋白lll(pIII)和蛋白姗(P姗)等衣壳蛋白基因区的N一端插入外源基因，形成


本文编号：2965916