SPAG6/SPINK2蛋白复合物在小鼠精子顶体形成中的作用初探

发布时间：2021-03-23 17:52

　　目的:初步探讨精子相关抗原6（SPAG6）在小鼠精子发生过程中顶体形成阶段的表达及其调控作用。方法:采用Western印迹检测出生后小鼠睾丸发育不同阶段（第8、12、16、20、24、28、30、35天）中SPAG6的表达;免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定位;分别构建SPAG6和SPINK2蛋白表达质粒,以AH109和CHO细胞为对象,采用酵母双杂交及细胞内共定位实验检测SPAG6与SPINK2蛋白间相互作用;免疫荧光检测SPINK2在SPAG6基因敲除（KO）小鼠的睾丸生精细胞中的表达与定位。结果:小鼠出生后第16～28天,SPAG6表达显著升高,且定位于圆形精子细胞的顶体;酵母双杂交实验显示SPAG6/SPINK2组能在选择性培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）中生长;CHO细胞共转染SPAG6和SPINK2表达质粒时,SPAG6与SPINK2共定位在细胞核周围;SPAG6 KO小鼠睾丸生精细胞中未检测到SPINK2表达及定位于精子顶体。结论:SPAG6与SPINK2形成蛋白复合体,并可能通过调控SPINK2的稳定表达参与精子顶体形成。 

【文章来源】：中华男科学杂志. 2019,25(03)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

SPAG6在小鼠第一波精子发生过程的表达Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)

图1SPAG6在小鼠第一波精子发生过程的表达Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)图2SPAG6定位于圆形精子细胞的顶体凝集素:精子顶体荧光标记(绿色);DAPI染色标记DNA(蓝色)Figure2．LocalizationofSPAG6intheacrosomeoftheroundspermatidsGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．2．3SPAG6与SPINK2蛋白发生相互作用构建pGBKT7/SPAG6和pGADT7/SPINK2重组质粒并采用直接酵母双杂交实验验证SPAG6与SPINK2相互作用。如图3结果所示，AH109菌株共转染了含pGADT7和pGBKT7载体能够在SD培养基同时缺少亮氨酸(-Leu)和色氨酸(-Trp)的平板上生长，但是不能在SD培养基同时缺少亮氨酸(-Leu)、色氨酸(-Trp)和组氨酸(-His)的平板上生长。同阳性对照组pGADT7/IgT+pGBKT7/p53一样，pGADT7/SPINK2+pGBKT7/SPAG6配对实验组能在非选择性(SD/-Leu/-Trp)和选择性培养基(SD/-Leu/-Trp/-His)中均有生长(图3A)。此外，构建蛋白表达质粒pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2共转染到CHO细胞，免疫荧光染色显示，单独转染pTarget/SPAG6或pEGFP-N2/SPINK2时，SPAG6和SPINK2分散在细胞质(图3Bb，3Bd)，当SPAG6与SPINK2共转染时，SPAG6与SPINK2共定位在细胞核周围(图3Bh)，表明SPAG6和SPINK2发生相互作用。2．4SPAG6缺失对小鼠睾丸生精细胞中SPINK2蛋白表达的影响免疫荧光检测显示，SPINK2定位于野生型小鼠生精细胞顶体，而SPAG6KO小鼠生精细胞中未检测到SPINK2和凝集素表达(图4)，可能导

图4SPAG6缺失对小鼠睾丸生精细胞中SPINK2蛋白表达的影响凝集素:精子顶体荧光标记(绿色);DAPI染色标记DNA(蓝色)Figure4．ExpressionoftheSPINK2proteininthetesticulargermcellsoftheSPAG6-knockout(KO)mouseGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．3讨论哺乳动物SPAG6最初被证明是维持精子鞭毛中心轴丝结构完整和调节精子鞭毛运动的重要蛋白［2］。研究SPAG6在第一波精子发生中的表达情况发现，在小鼠出生后第16～28天(即圆形精子期和伸长期［17-18］)，该蛋白表达量显著升高。而且，SPAG6定位于圆形精子的顶体。这些结果提示，SPAG6不仅调节精子鞭毛的摆动，而且可能调控精子发生过程。为了进一步研究SPAG6在精子发生中的作用，本课题组采用酵母双杂交筛选小鼠cDNA文库，发现SPINK2可能与SPAG6相互结合。通过直接酵母双杂交和细胞内共定位实验证实这两种蛋白能发生相互作用。SPINK2蛋白仅在小鼠睾丸及附睾组织中表达，并定位于圆形精子细胞的顶体囊泡和成熟精子的顶体［15，19］。研究SPINK2基因敲除小鼠发现，该蛋白缺失促使顶体酶原异常活化，过早释放顶体素，引起圆形精子细胞内高尔基体碎裂，前顶体颗粒(proacrosomalgranule)不能融合成顶体囊泡(acroso-malvesicle)，导致顶体形成受阻，生精细胞分化停滞在圆形精子细胞阶段，进而引起雄性不育［14］。结果表明SPINK2蛋白参与精子顶体形成，在精子变形期起着重要作用。泛素-蛋白酶体途径是细胞内一种蛋白质降解调节系统，在精子变形阶段的核小体重塑、顶体生物合成及精子尾部形成等过程中起着关键的调控作用［

【参考文献】：
期刊论文
[1]溶质载体家族22成员14和精子相关抗原6在特发性弱精子症患者精子中的表达[J]. 侯方圆,李玉山,杨夕阳,王全先,刘军杰,王琳凯,苏彦华,孙琳.  中华男科学杂志. 2017(08)
[2]泛素?蛋白酶体途径在精子生成中的作用[J]. 董莲花,冉茂良,李智,彭馥芝,陈斌.  遗传. 2016(09)
[3]不孕不育症的实验室研究进展[J]. 徐文莉,李康,罗艺.  检验医学与临床. 2012(16)



本文编号：3096184