RNA干扰表达系统的建立及对CR-1基因生物功能的研究

发布时间：2021-06-22 16:37

　　自从发现双链21碱基小干扰RNA可以引发特异性的基因沉寂，双链RNA介导的RNA干扰已经逐渐在抑制基因表达方面得到了广泛的应用。然而，由于目前广泛应用的是体外合成RNA转染细胞的方法；这个方法有合成成本高、转染效率低、容易降解、不能持续发挥作用等缺点。为了解决上述问题，利用人的U6核小RNA（human small nuclear RNA U6，简称hsnU6）基因单元的特性，构建了一种可嵌合于U6变体基因内部持续高效表达小干扰RNA，有效特异地抑制特定基因表达的全新载体系统。应用这套系统，检测了针对于绿色荧光蛋白基因和CR-1基因不同靶位点的小干扰RNA的作用效果。结果表明，RNA干扰作用效果与RNA二级结构相关。这些发现使这套DNA载体介导的RNA干扰表达系统能够在功能基因组研究方面广泛发挥作用，并有望成为基因治疗大家族中重要的一员。 细胞调控因子-1是由中国医学科学院王以光教授获得专利的一个新基因，GenBank号码为GI-21703347。与正常组织细胞相比，细胞调控因子-1在多种肿瘤细胞中富集，并且由酵母双杂交结果得知其与p21等多种蛋白相互作用。应用构建的小干扰RNA... 

【文章来源】：沈阳药科大学辽宁省

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
实验材料
实验方法
    1 大肠杆菌质粒DNA小量提取
    2 大肠杆菌质粒DNA大量提取
    3 限制酶切反应
    4 去磷酸化反应
    5 寡核苷酸片段的磷酸化
    6 PCR反应
    7 DNA电泳及片段回收
    8 DNA连接反应
    9 E.coli DH-5α感受态细胞的制备
    10 质粒DNA转化E.coli DH-5α
    11 E.coli转化子的快速鉴定
    12 真核细胞培养所用培养基的配制
    13 RNA抽提及准备
    14 RT-PCR
    15 Northrtn Blot
    16 Western Blot
    17 质粒转染真核细胞
    18 荧光显微观察及拍照
    19 细胞增殖速度测定
    20 测定细胞的周期变化及凋亡
    21 基因组DNA片段化的检测
    22 真核细胞的冻存
结果与讨论
    第一章 小干扰RNA体内高效表达系统的建立及检测
        一. 小干扰RNA体内高效表达系统的建立
            1 hsnU6RNA基因
            2 hsnU6RNA基因的PCR克隆
            3 U6变体基因的PCR克隆
            4 系统的完成
        二. 所构建的载体系统体外及体内活性鉴定
            1 U6变体RNA表达的体外检测
            2 RNA干扰的体内活性鉴定
    第二章 RNA干扰方法学的初步探讨
        一. RNA干扰靶位点的选择及重组质粒的构建
            1 RNA干扰靶位点的选择
            2 重组质粒的构建
        二. RNA干扰不同靶位点的作用效果比较
            1 针对绿色荧光蛋白基因不同靶位点的RNA干扰效果比较
            2 针对CR-1基因不同靶位点的RNA干扰效果比较
    第三章 细胞调控因子-1基因生物功能的研究
        一. 细胞调控因子-1基因(CR-1)表达的下调
            1 抑制CR-1基因的小干扰RNA表达质粒的构建
            2 CR-1基因表达水平的检测
            3 CR-1基因缺失突变株的筛选和检测
        二. 细胞调控因子-1基因(CR-1)生物功能的研究
            1 细胞形态学变化
            2 细胞增殖速度的变化
            3 细胞周期及凋亡的变化
结论
参考文献
致谢
硕士研究生期间发表及准备中的文章及专利



本文编号：3243175