EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

发布时间：2021-09-03 12:02

　　目的:建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法:首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（PpolⅠ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果:通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（trans... 

【文章来源】：重庆医科大学学报. 2019,44(11)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1主要试剂与质粒
    1.2 菌种、细胞与EV71病毒
    1.3 引物与载体构建
    1.4 从质粒中拯救EV71病毒
    1.5 拯救病毒的鉴定
2 结果
    2.1 EV71病毒拯救质粒的构建
    2.2 病毒的拯救及鉴定
    2.3 病毒的毒力鉴定及比较
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]Development and characterization of a clinical strain of Coxsackievirus A16 and an eGFP infectious clone[J]. Chenglin Deng,Xiaodan Li,Siqing Liu,Linlin Xu,Hanqing Ye,Cheng-Feng Qin,Bo Zhang.  Virologica Sinica. 2015(04)
[2]Viral kinetics of Enterovirus 71 in human habdomyosarcoma cells[J]. Hsiang-Fu Kung.  World Journal of Gastroenterology. 2011(36)



本文编号：3381076