人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定
发布时间：2021-10-22 01:50
目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的NGAL基因,构建原核表达重组质粒pW28-NGAL,IPTG诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的rhNGAL抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争ELISA法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE分析纯度;最后运用Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度NGAL重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得6株高效价单克隆抗体;其中,25号单抗为IgG1亚型,余者均属IgG2a亚型,且19、35号单抗的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109。SDS-PAGE分析表明纯度均大于90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结...
【文章来源】：重庆医科大学学报. 2019,44(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
密码子优化后设计的NGAL基因序列
NGAL纯化结果
重庆医科大学学报2019年第44卷第5期(JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.5)图5抗NGAL抗体免疫荧光结果（400×）2.2NGAL的聚集状态用已知分子量的标准蛋白质对HiloadSuperdex75凝胶层析柱进行定标，根据洗脱曲线将洗脱体积和蛋白相应分子量进行拟合可得：LogMW=-0.01712×Ve+6.01667。同等条件下，过NGAL蛋白样品，其洗脱体积约为96.6mL（图3）。结合公式算得其在溶液中分子量约为23kD，提示NGAL在PBS溶液（10mmol/LPBS，pH7.4）中主要以单体形式存在。与人体内天然存在的NGAL蛋白聚集形式一致[10]。2.3抗人NGAL抗体的制备本研究以纯化的rhNGAL包板，对挑选的单克隆行2次间接ELISA筛选，得到14株高效价阳性杂交瘤细胞株。使用抗体分型检测试剂对细胞上清进行亚类鉴定，最后得到6株杂交瘤细胞株并大量培养及冻存，其中25号为IgG1亚型，8、11、19、23、35号为IgG2a亚型。上清抗体效价最高的2株细胞经小鼠腹腔诱生法制腹水，产物用ProteinG柱纯化，得到单抗19、单抗35。以样品孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为判断标准，测得多抗1、多抗2、单抗19、单抗35纯化前后的效价，见表1；BCA法测得纯化后的4只抗体浓度分别为2.11、1.98、2.6和2.03mg/mL；经SDS-PAGE电泳分析（图4），抗体的纯度皆超过90%，可以满足后续实验要求；等温滴定量热法（isothermaltitrationcalorimetry，ITC）测得NGAL单克隆抗体19、35的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109，非竞争ELISA结果为2.62×109、1.72×109，两者基本一致。2.4抗人NG
【参考文献】：
期刊论文
[1]急性肾损伤的检测指标NGAL的研究进展[J]. 马玉国,赵红丽,任秀华,赵俊月,马玉国. 国际检验医学杂志. 2013(14)
[2]抗人NGAL单克隆抗体的制备及其定量检测方法的建立[J]. 何莹,郑怡麟,陈安,易维京,胡川闽. 免疫学杂志. 2013(01)
本文编号：3450145
【文章来源】：重庆医科大学学报. 2019,44(05)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
密码子优化后设计的NGAL基因序列
NGAL纯化结果
重庆医科大学学报2019年第44卷第5期(JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.5)图5抗NGAL抗体免疫荧光结果（400×）2.2NGAL的聚集状态用已知分子量的标准蛋白质对HiloadSuperdex75凝胶层析柱进行定标，根据洗脱曲线将洗脱体积和蛋白相应分子量进行拟合可得：LogMW=-0.01712×Ve+6.01667。同等条件下，过NGAL蛋白样品，其洗脱体积约为96.6mL（图3）。结合公式算得其在溶液中分子量约为23kD，提示NGAL在PBS溶液（10mmol/LPBS，pH7.4）中主要以单体形式存在。与人体内天然存在的NGAL蛋白聚集形式一致[10]。2.3抗人NGAL抗体的制备本研究以纯化的rhNGAL包板，对挑选的单克隆行2次间接ELISA筛选，得到14株高效价阳性杂交瘤细胞株。使用抗体分型检测试剂对细胞上清进行亚类鉴定，最后得到6株杂交瘤细胞株并大量培养及冻存，其中25号为IgG1亚型，8、11、19、23、35号为IgG2a亚型。上清抗体效价最高的2株细胞经小鼠腹腔诱生法制腹水，产物用ProteinG柱纯化，得到单抗19、单抗35。以样品孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为判断标准，测得多抗1、多抗2、单抗19、单抗35纯化前后的效价，见表1；BCA法测得纯化后的4只抗体浓度分别为2.11、1.98、2.6和2.03mg/mL；经SDS-PAGE电泳分析（图4），抗体的纯度皆超过90%，可以满足后续实验要求；等温滴定量热法（isothermaltitrationcalorimetry，ITC）测得NGAL单克隆抗体19、35的亲和常数分别为3.06×109、2.14×109，非竞争ELISA结果为2.62×109、1.72×109，两者基本一致。2.4抗人NG
【参考文献】：
期刊论文
[1]急性肾损伤的检测指标NGAL的研究进展[J]. 马玉国,赵红丽,任秀华,赵俊月,马玉国. 国际检验医学杂志. 2013(14)
[2]抗人NGAL单克隆抗体的制备及其定量检测方法的建立[J]. 何莹,郑怡麟,陈安,易维京,胡川闽. 免疫学杂志. 2013(01)
本文编号：3450145
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