登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达、活性研究及拮抗肽筛选

发布时间：2021-10-30 08:02

　　登革病毒（dengue virus）是人类登革热（DF）、登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的病原体。登革病毒感染严重威胁全球近半数人的健康,然而时至今日仍然没有有效的治疗药物和疫苗,因而探索抗登革病毒感染的新策略成为当今登革研究的热点。登革病毒非结构蛋白NS3,其编码基因在黄病毒中具有高度的保守性,基因全长1854bp,编码618个氨基酸,是病毒编码的第二大蛋白。NS3是一种多功能蛋白,N端具有Ser蛋白酶活性,C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性,参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5′端加帽。该蛋白具有很好的免疫原性,并存在特异性CD4⁺和CD8⁺识别表位,可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。鉴于NS3同时具有病毒复制所必需的多种酶活性及其良好的免疫原性,其已成为登革抗病毒药物设计的重要靶标。本研究工作分为以下三个部分: 1) DEN NS3表达体系的构建: 提取感染登革2型病毒的C6/36细胞总RNA,RT-PCR扩增目的基因,双酶切后连入表达载体,构建重组表达载体... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

NS3全长基因和表达质粒pETZSa一NS3的酶切鉴定电泳图

在含氨节青霉素的平板上选择阳性克隆，PCR及Hindlll、Nhel酶切分析鉴定阳性克隆，均获得相应的目的基因片段。重组原核表达质粒命名为pET32a一dNS3。图2为峪3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域(160一618aa)基因和表达质粒pET32a一dNS3的酶切鉴定电泳图。图2克隆基因和表达质粒pET32a一dNS3的酶切鉴定电泳图M:DNA标记物(marker):1.Hindlll单切pET28a对照质粒;2.Hindlll单切质粒pET32a一dNS3;3.Hindlll、BamHl双切质粒pET32a一dNS3;4.PCR产物

在含卡那霉素的平板上选择阳性克隆，PCR及Hindlll、Noc工酶切分析鉴定阳性克隆，获得相应大小的目的基因片段。重组原核表达质粒命名为pET28a一dNs3。图3为NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域(160一618aa)基因和表达质粒pET28-aNdS3的酶切鉴定电泳图。将筛选到的阳性克隆送上海生工测序，测序表明所克隆蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域基因与Genebank中登革2型病毒DZ一43株序列一致，未出现错意突变，酶切结果显示插入正确。图3克隆基因和表达质粒pET28a一dNS3的酶切鉴定电泳图M:DNA标记物(marker):1.Hindlll单切质粒pET28a一dNS3;2.Hindlll、Neol双切质粒pET28a一dNS3;3.Hindlll单切pET28a对照质粒:4.PCR产物.32重组蛋白的表达.32.1NS3全长蛋白的表达携带有重组表达质粒pET28a一NS3的工程菌经PITG诱导后表达一个分子量约为68kDa的特异蛋白，大小与预期一致，且对照菌无此蛋白出现。目的蛋白在宿主菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达，破碎菌体离心后的上清中无此蛋白出现，经诱导表达条件优化后，NS3全长蛋白其表达产物的可溶性未获得改盖


本文编号：3466380