CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因及表型分析

发布时间：2021-11-05 00:43

　　目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,观察和验证纯合子表型,初步探讨Lkb1对肾小管发育的影响。方法针对斑马鱼lkb1基因设计并体外合成gRNA,通过显微注射技术将gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一细胞期卵黄中,利用T7E1酶切和测序筛选出高效gRNA,通过测序筛选出F0代突变体及可遗传突变体,野生鱼和可遗传突变体鱼杂交产生F1代杂合子突变体,测序鉴定F1代杂合子突变类型,通过F1代杂合子自交产生F2代纯合子幼鱼,通过观察鉴定出纯合子表型;通过RT-PCR和免疫印迹验证纯合子表型;通过RT-PCR检测肾小管标志蛋白的mRNA水平。结果制备了斑马鱼lkb1 gRNA和Cas9 mRNA,筛选出三种产生移码突变的杂合子,发现斑马鱼lkb1基因敲除纯合子幼鱼受精后第5天游动时头尾剧烈摆动,异常兴奋,鱼鳔缺失,体轴弯曲,卵黄消耗过快,肝脏暗淡,肠道水肿,第8天大多数死亡;纯合子g6pase,pdk2b,pcpck1mRNA显著升高,Lkb1完全不表达;肾小管标志蛋白mRNA显著升高。结论利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,产生了肝脏衰竭,肠道水肿... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
英汉缩略词名词对照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼lkb1敲除模型
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 结论
第二部分 斑马鱼lkb1突变体鉴定及表型分析
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
参考文献
全文总结
文献综述
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术敲除faf1基因对斑马鱼软骨及肌节发育的影响[J]. 刘菁,梁森,袁志,黄慧哲.  第三军医大学学报. 2017(17)
[2]Attenuated LKB1-SIK1 signaling promotes epithelial-mesenchymal transition and radioresistance of non–small cell lung cancer cells[J]. Yuan-Hu Yao,Yan Cui,Xiang-Nan Qiu,Long-Zhen Zhang,Wei Zhang,Hao Li,Jin-Ming Yu.  Chinese Journal of Cancer. 2016(10)



本文编号：3476730