人类乳头状瘤病毒E6相关蛋白的原核表达及纯化
发布时间：2021-11-14 18:47
目的原核表达及纯化带GST标签的人类乳头状瘤病毒E6相关蛋白E6AP,为研究泛素化修饰与多种疾病的机制关联提供实验基础。方法以人卵巢文库为模板,利用PCR技术扩增E6AP编码序列,将其插入pGEXKG-GST载体中。利用DH5α感受态细胞鉴定重组质粒并大量克隆。质粒转入大肠杆菌Rossate菌株,小量诱导表达。利用GST融合蛋白纯化磁珠提取并纯化GST-E6AP融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western印迹检测纯化效率。结果 PCR技术成功获取大小约为2559 bp的E6AP编码序列,与pGEX-KG-GST载体连接,双酶切鉴定及公司测序结果显示GST-E6AP载体构建成功。转入Rossate菌株后诱导质粒小量表达,获取并提纯带有GST标签的E6AP重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Western印迹结果显示E6AP蛋白纯化成功。结论成功构建重组质粒并表达GSTE6AP蛋白,获取纯化E6AP蛋白,为进一步研究泛素化在疾病发生发展中的地位和作用奠定坚实基础。
【文章来源】：军事医学. 2019,43(05)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
目的基因E6AP的PCR扩增M.DNA标志物（BM15000）；
肗coⅠ和HindⅢ双酶切目的基因片段和载体，T4连接酶将目的基因与载体连接，转化至DH5a感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，获得成功转入载体的单克隆活化菌株。菌液PCR进一步筛选连接目的基因条带的菌株（图2）。提取质粒进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，可见约2559bp的目的基因条带和对照pGEXKGGST载体条带（图3）。结果证明，E6AP编码序列已与pGEXKGGST载体连接，并成功转入DH5a感受态细胞。质粒送测序，结果表明，目的基因的序列与预期一致，无突变位点。图2重组质粒GST-E6AP的菌液PCR鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1~4.挑取的不同菌落；P.阳性对照；N.阴性对照22.3重组质粒GSTE6AP的小量诱导表达GSTE6AP质粒转入Rossate菌株，挑取单克隆菌落并活化，加IPTG诱导蛋白小量表达。考马斯亮蓝染色和Western印迹检测诱导前后细菌的融合蛋白表达含量。考马斯亮蓝染色结果显示，经诱导后的Rossate菌株大量表达GSTE6AP融合蛋白（图4）。Western印迹进一步验证了GSTE6AP融合蛋白成功表达（图5）。E6AP蛋白相对分子质量约为100×103，由于连接GST标签，GSTE6AP融合蛋白相对分子质量偏大，符合预期。图3重组质粒GST-E6AP的酶切鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1.GST空载体+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ图4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白质相对分子质量标志物；Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后，箭头表示目的蛋白条带图5GST-E6AP融合蛋白的Western印迹分析Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后22.4融合蛋白GSTE6AP的纯化
阳性对照；N.阴性对照22.3重组质粒GSTE6AP的小量诱导表达GSTE6AP质粒转入Rossate菌株，挑取单克隆菌落并活化，加IPTG诱导蛋白小量表达。考马斯亮蓝染色和Western印迹检测诱导前后细菌的融合蛋白表达含量。考马斯亮蓝染色结果显示，经诱导后的Rossate菌株大量表达GSTE6AP融合蛋白（图4）。Western印迹进一步验证了GSTE6AP融合蛋白成功表达（图5）。E6AP蛋白相对分子质量约为100×103，由于连接GST标签，GSTE6AP融合蛋白相对分子质量偏大，符合预期。图3重组质粒GST-E6AP的酶切鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1.GST空载体+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ图4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白质相对分子质量标志物；Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后，箭头表示目的蛋白条带图5GST-E6AP融合蛋白的Western印迹分析Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后22.4融合蛋白GSTE6AP的纯化利用GST珠对GSTE6AP融合蛋白进行纯化，考马斯亮蓝染色结果显示，GSTE6AP融合蛋白纯化成功（图6）。UV法检测纯化后蛋白，纯度以D280/354
本文编号：3495162
【文章来源】：军事医学. 2019,43(05)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
目的基因E6AP的PCR扩增M.DNA标志物（BM15000）；
肗coⅠ和HindⅢ双酶切目的基因片段和载体，T4连接酶将目的基因与载体连接，转化至DH5a感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，获得成功转入载体的单克隆活化菌株。菌液PCR进一步筛选连接目的基因条带的菌株（图2）。提取质粒进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，可见约2559bp的目的基因条带和对照pGEXKGGST载体条带（图3）。结果证明，E6AP编码序列已与pGEXKGGST载体连接，并成功转入DH5a感受态细胞。质粒送测序，结果表明，目的基因的序列与预期一致，无突变位点。图2重组质粒GST-E6AP的菌液PCR鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1~4.挑取的不同菌落；P.阳性对照；N.阴性对照22.3重组质粒GSTE6AP的小量诱导表达GSTE6AP质粒转入Rossate菌株，挑取单克隆菌落并活化，加IPTG诱导蛋白小量表达。考马斯亮蓝染色和Western印迹检测诱导前后细菌的融合蛋白表达含量。考马斯亮蓝染色结果显示，经诱导后的Rossate菌株大量表达GSTE6AP融合蛋白（图4）。Western印迹进一步验证了GSTE6AP融合蛋白成功表达（图5）。E6AP蛋白相对分子质量约为100×103，由于连接GST标签，GSTE6AP融合蛋白相对分子质量偏大，符合预期。图3重组质粒GST-E6AP的酶切鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1.GST空载体+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ图4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白质相对分子质量标志物；Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后，箭头表示目的蛋白条带图5GST-E6AP融合蛋白的Western印迹分析Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后22.4融合蛋白GSTE6AP的纯化
阳性对照；N.阴性对照22.3重组质粒GSTE6AP的小量诱导表达GSTE6AP质粒转入Rossate菌株，挑取单克隆菌落并活化，加IPTG诱导蛋白小量表达。考马斯亮蓝染色和Western印迹检测诱导前后细菌的融合蛋白表达含量。考马斯亮蓝染色结果显示，经诱导后的Rossate菌株大量表达GSTE6AP融合蛋白（图4）。Western印迹进一步验证了GSTE6AP融合蛋白成功表达（图5）。E6AP蛋白相对分子质量约为100×103，由于连接GST标签，GSTE6AP融合蛋白相对分子质量偏大，符合预期。图3重组质粒GST-E6AP的酶切鉴定M.DNA标志物（BM15000）；1.GST空载体+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ图4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白质相对分子质量标志物；Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后，箭头表示目的蛋白条带图5GST-E6AP融合蛋白的Western印迹分析Pre.GSTE6AP诱导前；Post.GSTE6AP诱导后22.4融合蛋白GSTE6AP的纯化利用GST珠对GSTE6AP融合蛋白进行纯化，考马斯亮蓝染色结果显示，GSTE6AP融合蛋白纯化成功（图6）。UV法检测纯化后蛋白，纯度以D280/354
本文编号：3495162
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