温度敏感聚异丙基丙烯酰胺/聚精氨酸缀合物转基因载体
发布时间：2021-11-21 10:50
本工作制备了温度敏感性载体聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物（PNIPArg）,考察了PNIPArg和质粒DNA的相互作用,研究了不同温度下PNIPArg对小鼠成肌细胞（C2C12）的体外基因转染。具体工作主要包括以下方面:1.制备聚异丙基丙烯酰胺-聚精氨酸缀合物,并采用红外光谱和核磁共振光谱（13C NMR）方法确定产物的形成,浊度方法得到PNIPArg水溶液的低临界转变温度LCST为35.2℃。2.考察PNIPArg和质粒DNA形成的复合物的物化性质,研究温度响应性对于复合物的形成、复合物的大小以及稳定性的影响。透射电镜的结果表明复合物呈均一的小球状,其粒径分布在50-100nm左右。圆二色谱实验表明,PNIPArg载体对DNA构象的影响不大,温度高于LCST可以使复合物结合地更紧密。琼脂糖凝胶电泳及其酶解实验都表明升高复合物形成的温度可以促进复合物的形成,提高复合物的稳定性。3.以C2C12细胞为宿主细胞,考察聚精氨酸载体和温度敏感PNIPArg载体对于介导含有荧光素酶（luciferase）和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因系统的质粒PGL3和pEGFP-C1的体外转染。结果证实P...
【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
非病毒载体/DNA复合物的转基因过程示意图
通过图1－1 可以看出作为非病毒载体必须克服以下几个苛刻的条件；1.其必须能缩合DNA，形成中性或正电性的复合物，避免细胞毒性及与其它细胞或带电分子（如细胞外基质、蛋白特别是补体蛋白）的相互作用，这在体内应用是很必要的；2.其必须能形成紧密稳定的能被细胞内在化的复合物，这有利于其在血流内扩散和帘式内皮膜的外渗；3.其必须能够调控特定的细胞识别并进入目的细胞，减小非特异的基因释放；4.其必须能够从内涵体中逃逸出来并能够释放外源基因在细胞核内表达。成功的基因转运还需要保护DNA免受细胞内核酶的降解，能从内吞小泡中释放DNA或者复合物，同时复合物必须能够在某一阶段解离，复合物扩散通过胞质溶胶及DNA高效进入细胞核内。目前所开发的非病毒载体还不能完全达到这些要求[1]。图 1-1 非病毒载体/DNA 复合物的转基因过程示意图1.2.1 裸 DNA裸 DNA 是结构最简单的非病毒载体，由于其需要避开细胞内外的屏障才能发挥作用，因此一般都采用物理方法（如基因枪，超声波，电出孔）导入基因转染的特定部位（如骨骼肌肉，肝脏，心肌）。但裸 DNA 缺乏靶向性，并且只能3
其作为转基因载体主要有两种结构：线性聚乙烯基亚胺（L-PEI）和支化聚乙烯基亚胺（B-PEI）（如图1－3）。PEI的叔胺氮原子可以质子化，人们形象的将其称为“质子海绵”。与其他的高聚物载体（聚赖氨酸等）不同，PEI在所有的pH范围内都表现出很好的缓冲能力，在生理pH条件下，只有大约 20％的PEI被质子化[32]。PEI有很高的转基因的能力，被认为是由于其较高的正电荷密度，并基于这样的假设：当细胞的囊泡的pH值变为酸性时，质子化的PEI可以发生渗透性溶胀使囊泡破裂，将PEI携带的DNA由囊泡释放到胞浆中。虽然真正的机理还有待进一步研究，但可以证明PEI确实是转基因的有效载体[33]。但较高的电荷密度使PEI存在明显的细胞毒性
【参考文献】：
期刊论文
[1]壳聚糖纳米粒用作基因递送载体的初步研究[J]. 黄伟,崔光华,贺俊峰,周旭,张强. 药学学报. 2002(12)
[2]纳米粒子介导特异基因转染的实验研究[J]. 李拥军,管珩,刘昌伟,郑曰宏,赵三妹,王宗立,杨菁,宋存先. 中华医学杂志. 2002(05)
本文编号：3509371
【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
非病毒载体/DNA复合物的转基因过程示意图
通过图1－1 可以看出作为非病毒载体必须克服以下几个苛刻的条件；1.其必须能缩合DNA，形成中性或正电性的复合物，避免细胞毒性及与其它细胞或带电分子（如细胞外基质、蛋白特别是补体蛋白）的相互作用，这在体内应用是很必要的；2.其必须能形成紧密稳定的能被细胞内在化的复合物，这有利于其在血流内扩散和帘式内皮膜的外渗；3.其必须能够调控特定的细胞识别并进入目的细胞，减小非特异的基因释放；4.其必须能够从内涵体中逃逸出来并能够释放外源基因在细胞核内表达。成功的基因转运还需要保护DNA免受细胞内核酶的降解，能从内吞小泡中释放DNA或者复合物，同时复合物必须能够在某一阶段解离，复合物扩散通过胞质溶胶及DNA高效进入细胞核内。目前所开发的非病毒载体还不能完全达到这些要求[1]。图 1-1 非病毒载体/DNA 复合物的转基因过程示意图1.2.1 裸 DNA裸 DNA 是结构最简单的非病毒载体，由于其需要避开细胞内外的屏障才能发挥作用，因此一般都采用物理方法（如基因枪，超声波，电出孔）导入基因转染的特定部位（如骨骼肌肉，肝脏，心肌）。但裸 DNA 缺乏靶向性，并且只能3
其作为转基因载体主要有两种结构：线性聚乙烯基亚胺（L-PEI）和支化聚乙烯基亚胺（B-PEI）（如图1－3）。PEI的叔胺氮原子可以质子化，人们形象的将其称为“质子海绵”。与其他的高聚物载体（聚赖氨酸等）不同，PEI在所有的pH范围内都表现出很好的缓冲能力，在生理pH条件下，只有大约 20％的PEI被质子化[32]。PEI有很高的转基因的能力，被认为是由于其较高的正电荷密度，并基于这样的假设：当细胞的囊泡的pH值变为酸性时，质子化的PEI可以发生渗透性溶胀使囊泡破裂，将PEI携带的DNA由囊泡释放到胞浆中。虽然真正的机理还有待进一步研究，但可以证明PEI确实是转基因的有效载体[33]。但较高的电荷密度使PEI存在明显的细胞毒性
【参考文献】：
期刊论文
[1]壳聚糖纳米粒用作基因递送载体的初步研究[J]. 黄伟,崔光华,贺俊峰,周旭,张强. 药学学报. 2002(12)
[2]纳米粒子介导特异基因转染的实验研究[J]. 李拥军,管珩,刘昌伟,郑曰宏,赵三妹,王宗立,杨菁,宋存先. 中华医学杂志. 2002(05)
本文编号：3509371
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