肠道病毒71型3A蛋白肽段抗体的制备
发布时间:2021-11-28 12:27
目的制备肠道病毒71型(EV-A71)3A蛋白的肽段抗体。方法利用ExPasy和DNAstar软件对EV-A71 3A蛋白的跨膜结构域、二级结构、亲水性及疏水性等生物学特性进行分析,设计并合成2条14个氨基酸的多肽。用钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联肽段作为抗原分别免疫Balb/c小鼠,免疫结束后取小鼠全血分离血清,用免疫印迹实验(Western blot)对血清中的3A蛋白抗体进行鉴定。结果 Western blot结果显示,第一条3A蛋白的多肽不能刺激小鼠产生特异性抗体,而第二条多肽能够刺激小鼠产生特异性抗体。结论成功制备特异性较好的3A肽段抗体,为进一步研究3A蛋白提供了工具。
【文章来源】:中国病毒病杂志. 2019,9(04)
【文章页数】:5 页
【部分图文】:
图1高效液相色谱法测定肽段的纯度注:A为高效液相
毒感染细胞裂解液反应,结果如图2所示,用多肽-1免疫的小鼠血清在3A蛋白对应相对分子质量11×103处未见条带(图2中1~3),提示多肽-1处理的的小鼠血清中没有3A蛋白的特异性抗体,这可能是多肽-1的免疫原性较差未能刺激小鼠产生相应免疫应答所致;而多肽-2免疫的小鼠血清在目标分子量处有明显条带(图2中4~6)提示多肽-2免疫的小鼠血清中存在EV-A713A蛋白的特异性抗体。2.4多肽抗体的IFA鉴定用多肽免疫的小鼠血清作为一抗,与EV-A71感染的RD细胞孵育,IFA鉴定血清中的抗体,结果如图3所示,多肽-1免疫的小鼠血清处理的被感染细胞中未见到红色荧光,而多肽-2免疫的小鼠血清处理的被感染细胞中有明显红色荧光,提示多肽-1免疫的小鼠血清中没有能与3A有效结合的抗体,而多肽-2免疫的小鼠血清中存在3A的抗体,这与WB的结果一致。注:A为高效液相色谱法测定多肽-1的纯度;B为高效液相色谱法测定多肽-2的纯度。图1高效液相色谱法测定肽段的纯度注:1~3为多肽-1处理小鼠的血清平行样本;4~6为多肽-2处理小鼠的血清平行样本。图2WB法检测肽段抗体中国病毒病杂志2019年7月第9卷第4期ChinJViralDis,July2019,Vol.9No.4·562·
注:DAPI、PE和Merge为3种荧光染料。图3多肽-1抗体和多肽-2抗体的IFA鉴定结果(×600)3讨论EV-A71的3A蛋白是由病毒基因组编码的非结构蛋白之一,由87个氨基酸组成,其C端有1个疏水域,其N端为富含脯氨酸的结构域[7]。3A蛋白在脊髓灰质炎病毒中具有抑制内质网向高尔基体的转运、参与RNA复制、维持分子伴侣活性、锚定3D聚合酶等作用,在病毒的复制中扮演着重要角色。同时,3A蛋白在脊髓灰质炎病毒中表现出高度的保守性,我们猜测,在同为肠道病毒的EV-A71中,3A蛋白可能也具有相似的特性与功能[8-10]。已有研究表明,EV-A713A蛋白通过作用于高尔基体的ACBD3蛋白促进PI4KB与ACBD3的相互作用从而增强病毒复制[11-12]。同时,3A蛋白还能与3B蛋白一起参与构成具有RNA伴侣活性的3AB蛋白,在EV-A71的复制中进一步起到关键作用[13]。因此3A蛋白的研究对于EV-A71的感染机制及抗病毒治疗可能具有重大意义。尽管已有关于作用于3A蛋白的药物研究,EV-A71全病毒灭活疫苗也进入临床运用阶段,但对EV-A71的实验室研究仍是必不可少的。然而目前在国内外的研究中对3A蛋白功能的解释尚未完全明确[14-18]。因此,深入研究EV-A71病毒3A蛋白在病毒生命周期中的作用是十分必要的,有利于进一步了解EV-A71及小RN
本文编号:3524427
【文章来源】:中国病毒病杂志. 2019,9(04)
【文章页数】:5 页
【部分图文】:
图1高效液相色谱法测定肽段的纯度注:A为高效液相
毒感染细胞裂解液反应,结果如图2所示,用多肽-1免疫的小鼠血清在3A蛋白对应相对分子质量11×103处未见条带(图2中1~3),提示多肽-1处理的的小鼠血清中没有3A蛋白的特异性抗体,这可能是多肽-1的免疫原性较差未能刺激小鼠产生相应免疫应答所致;而多肽-2免疫的小鼠血清在目标分子量处有明显条带(图2中4~6)提示多肽-2免疫的小鼠血清中存在EV-A713A蛋白的特异性抗体。2.4多肽抗体的IFA鉴定用多肽免疫的小鼠血清作为一抗,与EV-A71感染的RD细胞孵育,IFA鉴定血清中的抗体,结果如图3所示,多肽-1免疫的小鼠血清处理的被感染细胞中未见到红色荧光,而多肽-2免疫的小鼠血清处理的被感染细胞中有明显红色荧光,提示多肽-1免疫的小鼠血清中没有能与3A有效结合的抗体,而多肽-2免疫的小鼠血清中存在3A的抗体,这与WB的结果一致。注:A为高效液相色谱法测定多肽-1的纯度;B为高效液相色谱法测定多肽-2的纯度。图1高效液相色谱法测定肽段的纯度注:1~3为多肽-1处理小鼠的血清平行样本;4~6为多肽-2处理小鼠的血清平行样本。图2WB法检测肽段抗体中国病毒病杂志2019年7月第9卷第4期ChinJViralDis,July2019,Vol.9No.4·562·
注:DAPI、PE和Merge为3种荧光染料。图3多肽-1抗体和多肽-2抗体的IFA鉴定结果(×600)3讨论EV-A71的3A蛋白是由病毒基因组编码的非结构蛋白之一,由87个氨基酸组成,其C端有1个疏水域,其N端为富含脯氨酸的结构域[7]。3A蛋白在脊髓灰质炎病毒中具有抑制内质网向高尔基体的转运、参与RNA复制、维持分子伴侣活性、锚定3D聚合酶等作用,在病毒的复制中扮演着重要角色。同时,3A蛋白在脊髓灰质炎病毒中表现出高度的保守性,我们猜测,在同为肠道病毒的EV-A71中,3A蛋白可能也具有相似的特性与功能[8-10]。已有研究表明,EV-A713A蛋白通过作用于高尔基体的ACBD3蛋白促进PI4KB与ACBD3的相互作用从而增强病毒复制[11-12]。同时,3A蛋白还能与3B蛋白一起参与构成具有RNA伴侣活性的3AB蛋白,在EV-A71的复制中进一步起到关键作用[13]。因此3A蛋白的研究对于EV-A71的感染机制及抗病毒治疗可能具有重大意义。尽管已有关于作用于3A蛋白的药物研究,EV-A71全病毒灭活疫苗也进入临床运用阶段,但对EV-A71的实验室研究仍是必不可少的。然而目前在国内外的研究中对3A蛋白功能的解释尚未完全明确[14-18]。因此,深入研究EV-A71病毒3A蛋白在病毒生命周期中的作用是十分必要的,有利于进一步了解EV-A71及小RN
本文编号:3524427
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