人Lipocalin型前列腺素D合成酶的真核表达及单克隆抗体的制备

发布时间：2021-12-28 04:29

　　Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS）亦称β-trace protein，是机体组织屏障的主要成分，属Lipocalin家族。Lipocalins为一组分子量较小的分泌性蛋白质，它们的共同特性是可结合和运输亲脂／疏水分子，L-PGDS为此家族中惟一有酶活性者。L-PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄性生殖器官，并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白，除催化PGD₂产生外，亦可结合和运输亲脂／疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用，它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答有关，亦是一种生育相关蛋白，可能参与精子的发生和成熟。研究显示，对于一些神经系统疾病、肾脏疾病、心血管疾病、生殖系统疾病等，L-PGDS已成为一个有用的诊断指标。为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等，就必须得到大量的纯化L-PGDS抗原和相应的抗体。 本研究第一部分首先用PCR的... 

【文章来源】：南京医科大学江苏省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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英文摘要
引言
第一部分 Lipocalin型前列腺素D合成酶真核表达载体的构建
    1 材料和方法
        1.1 实验材料、仪器和试剂
        1.2 引物设计与合成
        1.3 测序载体的构建及鉴定
            1.3.1 PCR扩增L-PGDS基因片段
            1.3.2 测序载体pGEM-T/htL-PGDS的构建
            1.3.3 鉴定和序列分析
        1.4 pPIC9/htL-PGDS重组表达质粒的构建
        1.5 重组质粒的鉴定
    2 结果
        2.1 L-PGDS的扩增结果
        2.2 测序载体的构建和序列分析
        2.3 L-PGDS真核表达载体的构建
    3 讨论
第二部分 L-PGDS酵母表达菌株的建立
    1 材料和方法
        1.1 主要实验材料、仪器和试剂
        1.2 主要试剂配制
            1.2.1 贮存液的配制
            1.2.2 培养基的配制
        1.3 待转化DNA的制备
            1.3.1 质粒pPIC9/htL-PGDS和pPIC9的线性化
            1.3.2 乙醇沉淀回收DNA
        1.4 感受态酵母细胞的制备
        1.5 L-PGDS基因的电转化
        1.6 酵母转化菌的鉴定
        1.7 表型的鉴定
        1.8 L-PGDS表达阳性克隆的筛选
        1.9 不同诱导时间重组L-PGDS的表达
        1.10 表达量的初步分析
    2 结果
        2.1 质粒pPIC9/htL-PGDS的酵母转化
        2.2 表型鉴定
        2.3 表达阳性克隆的筛选
        2.4 不同诱导时间重组L-PGDS的表达
        2.5 表达量的初步分析
    3 讨论
第三部分 L-PGDS的大规模诱导表达、纯化和鉴定
    1 材料和方法
        1.1 主要实验材料、仪器和试剂
        1.2 L-PGDS的大规模诱导表达
        1.3 重组蛋白质的纯化
            1.3.1 硫酸氨沉淀法浓缩酵母培养上清
            1.3.2 镍离子亲和层析
        1.4 L-PGDS糖链的水解
        1.5 纯化蛋白的生物学活性检测
        1.6 重组L-PGDS的免疫印迹
    2 结果
        2.1 L-PGDS的表达、纯化
        2.2 重组L-PGDS的糖基化分析
        2.3 重组L-PGDS的生物学活性
        2.4 重组L-PGDS的Western印迹
    3 讨论
第四部分 分泌L-PGDS单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定
    1 材料与方法
        1.1 主要实验材料、仪器和方法
        1.2 免疫脾细胞制备
            1.2.1 免疫BALB／c小鼠
            1.2.2 制备免疫脾细胞悬液
        1.3 饲养细胞的制备
        1.4 细胞融合
        1.5 杂交瘤细胞观察及换液
        1.6 分泌L-PGDS McAb阳性克隆的检测
        1.7 阳性克隆有限稀释
        1.8 腹水型单克隆抗体的制备
        1.9 单克隆抗体的鉴定
            1.9.1 单克隆抗体亚类测定
            1.9.2 效价测定
            1.9.3 特异性鉴定
                1.9.3.1 L-PGDS McAb与精浆中L-PGDS的蛋白印迹
                1.9.3.2 L-PGDS McAb与重组L-PGDS的蛋白印迹
                1.9.3.3 免疫阻断试验
    2 结果
        2.1 杂交瘤细胞株的建立
        2.2 单克隆抗体亚类测定结果
        2.3 L-PGDS McAb的效价测定结果
        2.4 特异性鉴定
            2.4.1 L-PGDS McAb与精浆中L-PGDS的蛋白印迹
            2.4.2 L-PGDS McAb与重组L-PGDS的蛋白印迹
            2.4.3 免疫阻断试验结果
    3 讨论
小结
参考文献
研究生期间主要学术成果
致谢
综述及参考文献



本文编号：3553401