脑膜炎球菌fHBP的克隆表达与免疫原性研究
发布时间：2022-01-06 19:18
目的选用pET蛋白表达系统重组表达A、B两个亚家族的fHBP蛋白（fHBP-A和fHBP-B）,制备脑膜炎球菌蛋白疫苗,并对其进行免疫原性检测,评价该蛋白疫苗抵抗脑膜炎球菌感染的保护作用。方法以脑膜炎球菌Nm048（A家族）与Nm035（B家族）菌株裂解液为模版扩增目的基因fHBP-A与fHBP-B,与原核表达载体pET-24b连接,构建重组质粒pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B。分别用pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B转化大肠埃希菌,通过Western blot检测目的蛋白表达情况并用Ni2+柱层析和凝胶过滤层析进行纯化。将家兔随机分为4组,fHBP-A实验组、fHBP-B实验组、fHBP-A+fHBP-B实验组用相应重组蛋白免疫,对照组注射PBS。采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测免疫家兔抗血清与靶菌的结合情况,通过血清杀菌力试验（serum bactericidal assay,SBA）评价该疫苗诱导的免疫保护效果。结果 PCR扩增出约760 bp的目的基因片段,经双酶切和测序鉴定重组质...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(02)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１重组质粒的双酶切鉴定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）
破菌，取上清，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，结果见图２。表达蛋白的相对分子质量约为３７×１０３，与重组ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的相对分子质量理论值相符。Ｍ蛋白分子质量标准１重组ｆＨＢＰ－Ａ蛋白２重组ｆＨ－ＢＰ－Ｂ蛋白图２重组ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂｐｒｏｔｅｉｎ３表达产物的纯化及鉴定取重组菌超声破碎后上清进行Ｎｉ２＋柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化，纯化后的重组蛋白经凝胶图像系统处理分析，纯度均＞９５％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测纯化的重组蛋白均可与抗Ｈｉｓ－ｔａｇ单克隆抗体发生特异性结合（图３）。Ｍ蛋白分子质量标准１纯化的重组ｆＨＢＰ－Ａ蛋白与相应抗体的反应条带２纯化的重组ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白与相应抗体的反应条带图３纯化的重组蛋白产物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４免疫家兔特异ＩｇＧ抗体滴度采用ＥＬＩＳＡ检测实验家兔末次免疫后７～１０ｄ血清特异ＩｇＧ抗体滴度ｆＨＢＰ－Ａ、ｆＨＢＰ－Ｂ、ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫组１／ＧＭＴ分别为１．８×１０４、４．９×１０５、４．８×１０５。５抗体与Ｎｍ菌的结合反应流式细胞
４．９×１０５、４．８×１０５。５抗体与Ｎｍ菌的结合反应流式细胞术检测２个重组蛋白与分别表达Ａ，Ｂ两个亚家族ｆＨＢＰ蛋白的Ｎｍ０４８与Ｎｍ０３５的结合反应，以Ｎｍ２９０１９、Ｎｍ２９０２２全菌体免疫所得兔血清为阳性对照，结果见图５。各抗血清均能与Ｎｍ０３５和Ｎｍ０４８均发生特异性结合反应，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫家兔抗血清与靶菌的结合具有交叉反应性，而单一组分重组蛋白抗血清则表现出一定的家族特异性。图４ＥＬＩＳＡ测定重组蛋白免疫家兔血清特异ＩｇＧ抗体滴度（１／ＧＭＴ）Ｆｉｇ．４ＥＬＩＳＡｔｉｔｅｒｓ（１／ＧＭＴ）ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂ注（Ｎｏｔｅ）：Ｐ为阳性对照（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）。图５流式细胞术检测抗重组蛋白抗体与菌体的结合反应Ｆｉｇ．５Ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｂａｃｔｅｒｉａｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ６抗血清杀菌力检测利用Ｎｍ０３５与Ｎｍ０４８两个菌株对各组抗血清进行保护作用评估，结果见图６。ｆＨＢＰ－Ａ抗血清和ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清分别对Ｎｍ０４８与Ｎｍ０３５具有一定的杀菌作用，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清对两菌株均具有杀菌作用。图６重组蛋白抗血清杀菌力检测Ｆｉｇ．６Ｔｈｅｓｅｒｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ讨论本研究构建了ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨＢＰ－Ａ与ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨ－ＢＰ－Ｂ２
本文编号：3573024
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(02)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１重组质粒的双酶切鉴定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）
破菌，取上清，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，结果见图２。表达蛋白的相对分子质量约为３７×１０３，与重组ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的相对分子质量理论值相符。Ｍ蛋白分子质量标准１重组ｆＨＢＰ－Ａ蛋白２重组ｆＨ－ＢＰ－Ｂ蛋白图２重组ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂｐｒｏｔｅｉｎ３表达产物的纯化及鉴定取重组菌超声破碎后上清进行Ｎｉ２＋柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化，纯化后的重组蛋白经凝胶图像系统处理分析，纯度均＞９５％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测纯化的重组蛋白均可与抗Ｈｉｓ－ｔａｇ单克隆抗体发生特异性结合（图３）。Ｍ蛋白分子质量标准１纯化的重组ｆＨＢＰ－Ａ蛋白与相应抗体的反应条带２纯化的重组ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白与相应抗体的反应条带图３纯化的重组蛋白产物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４免疫家兔特异ＩｇＧ抗体滴度采用ＥＬＩＳＡ检测实验家兔末次免疫后７～１０ｄ血清特异ＩｇＧ抗体滴度ｆＨＢＰ－Ａ、ｆＨＢＰ－Ｂ、ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫组１／ＧＭＴ分别为１．８×１０４、４．９×１０５、４．８×１０５。５抗体与Ｎｍ菌的结合反应流式细胞
４．９×１０５、４．８×１０５。５抗体与Ｎｍ菌的结合反应流式细胞术检测２个重组蛋白与分别表达Ａ，Ｂ两个亚家族ｆＨＢＰ蛋白的Ｎｍ０４８与Ｎｍ０３５的结合反应，以Ｎｍ２９０１９、Ｎｍ２９０２２全菌体免疫所得兔血清为阳性对照，结果见图５。各抗血清均能与Ｎｍ０３５和Ｎｍ０４８均发生特异性结合反应，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫家兔抗血清与靶菌的结合具有交叉反应性，而单一组分重组蛋白抗血清则表现出一定的家族特异性。图４ＥＬＩＳＡ测定重组蛋白免疫家兔血清特异ＩｇＧ抗体滴度（１／ＧＭＴ）Ｆｉｇ．４ＥＬＩＳＡｔｉｔｅｒｓ（１／ＧＭＴ）ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂ注（Ｎｏｔｅ）：Ｐ为阳性对照（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）。图５流式细胞术检测抗重组蛋白抗体与菌体的结合反应Ｆｉｇ．５Ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｂａｃｔｅｒｉａｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ６抗血清杀菌力检测利用Ｎｍ０３５与Ｎｍ０４８两个菌株对各组抗血清进行保护作用评估，结果见图６。ｆＨＢＰ－Ａ抗血清和ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清分别对Ｎｍ０４８与Ｎｍ０３５具有一定的杀菌作用，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清对两菌株均具有杀菌作用。图６重组蛋白抗血清杀菌力检测Ｆｉｇ．６Ｔｈｅｓｅｒｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ讨论本研究构建了ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨＢＰ－Ａ与ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨ－ＢＰ－Ｂ２
本文编号：3573024
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