采用杆状病毒/昆虫表达系统纯化蛋白制备抗hUTP14a多克隆抗体

发布时间：2022-01-19 22:35

　　为制备兔抗人hUTP14a多克隆抗体并鉴定其抗体的特异性,本研究通过杆状病毒/昆虫表达系统制备并纯化Flag-hUTP14a-his蛋白,免疫新西兰家兔。ELISA方法检测免疫兔的抗血清滴度达到1∶10⁵（体积比）时取血清,并通过Protein A免疫亲和层析柱纯化抗体。在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）中过表达Flag-hUTP14a,或用小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）沉默内源的hUTP14a蛋白表达后,提取细胞总蛋白质。经Western印迹分析制备的多克隆抗体的特异性;通过细胞免疫化学染色、细胞免疫荧光、免疫组织化学染色和免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）实验对hUTP14a抗体的特异性进行鉴定。研究证实,制备的抗hUTP14a多克隆抗体能够特异性识别内源及外源表达的hUTP14a蛋白。该抗体可以用于细胞免疫荧光、细胞免疫化学染色、免疫组织化学染色、Western印迹及免疫沉淀等技术,为进一步研究hUTP14a的生物学... 

【文章来源】：中国生物化学与分子生物学报. 2019,35(03)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 构建pFastbac I重组杆状病毒质粒
    1.3 重组杆状病毒感染Sf9细胞
    1.4 重组Flag-hUTP14a-His蛋白的表达、纯化及鉴定
    1.5 纯化的Flag-hUTP14a-his蛋白免疫新西兰大白兔, 制备抗hUTP14a多克隆抗体
    1.6 Protein A亲和层析法纯化兔抗人hUTP14a IgG
    1.7 细胞培养和转染
    1.8 细胞总蛋白质的提取和Western 印迹
    1.9 免疫荧光和细胞化学染色
    1.10 免疫组织化学染色
    1.11 免疫沉淀 (IP)
2 结果
    2.1 采用蓝白斑筛选及PCR方法鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-Flag-hUTP14a-His并测序
    2.2 重组的杆状病毒感染昆虫细胞
    2.3 P2代病毒感染昆虫细胞时的稀释比例的确定
    2.4 Ni珠纯化Flag-hUTP14a-His蛋白和纯化蛋白质的定量
    2.5 用Western印迹检测hUTP14a抗体的特异性
    2.6 免疫化学染色方法和间接免疫荧光的方法在细胞中检测hUTP14a抗体的特异性
    2.7 用免疫组织化学染色方法在临床肿瘤组织检测hUTP14a抗体的特异性
    2.8 用免疫沉淀的方法检测抗hUTP14a抗体的特异性
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]重组人白血病抑制因子的表达、包涵体复性、纯化及其活性[J]. 张鹤铭,焦雪苗,甘龙站,田杰伟,田永强.  应用与环境生物学报. 2018(01)
[2]人P53的原核表达及包涵体复性研究[J]. 刘慧,张守涛,郭亚楠.  河南师范大学学报(自然科学版). 2016(04)
[3]Protein A/G亲和层析在HCV抗体纯化中的应用效果[J]. 杨蓉,谢忠平,龙润乡,白惠珠,谭振国,王燕,吴忠香,张勇.  医学研究杂志. 2010(01)
[4]KIAA0649多克隆抗体的制备及其细胞内定位[J]. 郑宗方,韩巍,何其华,柯杨,杜晓娟.  北京大学学报(医学版). 2009(06)



本文编号：3597687