结核分枝杆菌分泌蛋白Rv0674的特异性结合肽的筛选
发布时间：2022-02-21 08:35
目的制备结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）分泌蛋白Rv0674,筛选与Rv0674蛋白特异性结合的肽分子。方法用PCR从MTB（H37Rv）基因组中扩增出Rv0674基因。克隆到pEASY-E1表达载体上,将测序验证正确的重组表达质粒转化入E. coli BL21中,用IPTG诱导蛋白表达,Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,将纯化后的Rv0674蛋白包被到96孔板上,再利用噬菌体展示技术,经过连续4轮特异性亲和筛选,对第4轮产物随机挑取单独的噬菌斑,提取基因组并测序,用SnapGene 4.1.4比对并翻译多肽的基因序列。结果构建了Rv0674序列正确的重组表达质粒,获得分子量约为26.5kD的可溶性Rv0674蛋白。从第4轮的洗脱物中,随机挑选40个噬菌斑。测序结果可翻译成10种多肽分子,其中重复19次的多肽序列为TSTMMMHMNL。结论通过噬菌体展示技术筛选到TSTMMMHMNL多肽序列,对Rv0674蛋白的亲和力和特异性最好。
【文章来源】：宁夏医科大学学报. 2019,41(06)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
淘选噬菌体滴度图
与预期大小为780bp的Rv0674结果相符，见图1。2.2Rv0674的纯化纯化的Rv0674蛋白经SDS-PAGE鉴定，获得了大量的高纯度的可溶性蛋白质，其分子量略大于25kDa，与Rv0674预测的分子量26.5kDa一致，见图2。2.3Rv0674特异性结合肽筛选2.3.1滴度测定以Rv0674为靶分子，每轮筛选后对收集到的噬菌体进行滴度测定，见图3。2.3.24轮筛选结果以Rv0674为靶分子，使噬菌体表面展示的随机多肽与之结合，经4轮“吸附-淘洗-洗脱-扩增”后，第3轮得到的是第2轮的36.4倍，第4轮是第3轮的4倍；提示噬菌体得到明显富集，见表1。2.4筛选结果从第4轮产物中随机挑取40个噬菌体单克隆进行核苷酸序列测定，结果表明2、3、4、5、10、13、17、19、20、21、22、25、26、27、28、29、32、35、36号共19个噬菌体所携带的核苷酸序列和翻译出的多肽氨基序列相同，分别为ACCTCCACCAT－GATGATGCATATGAATCTT和TSTMMMHMNL，该类多肽实现了富集。同时也筛选到了其他9种多肽，提示这些多肽可能对Rv0674蛋白的亲和力和特异性比较好，见表2。3讨论TB是由MTB引起的危害全球人类健康的重大传染性疾病之一，目前在用于临床TB诊断的几种方法中，虽然细菌学诊断一直是TB诊断的金标准[9]，但耗时长，假阳性率高[10]。而血清学诊断简单、快速、高效、低廉，成为近几年来研究的热点[11]，但单一的抗原检测往往不能同时满足高灵敏性和特异性的要求[12]。研究[13]发现，通过MTB分泌蛋白抗原T细胞表位展示的外源性多肽分子，将其应用于TB的血清学诊断，能够满足快速、灵敏的诊断要求。感染MTB的病人，在出现临床症状前几个月甚至几年就存在MTB分泌抗原的抗体。因此MTB分泌性蛋白的相关研究引起了越来越多的人关注，对多种分泌性蛋白如ESAT-6[14]
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达结核分枝杆菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究[J]. 刘晶,张赞,刘洋,杨桂连,姜延龙,王春凤. 中国免疫学杂志. 2019(01)
[2]结核分枝杆菌分泌蛋白调控巨噬细胞自噬诱导持续性感染[J]. 张彩勤,杨丽,张廷芬,师长宏. 科学技术与工程. 2018(32)
[3]噬菌体展示技术在药物研发中的应用[J]. 侯雪莹,胡卓伟,崔冰. 药学学报. 2018(08)
[4]结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备[J]. 李国涛,臧珂. 应用预防医学. 2017(04)
[5]Rv2031c、38kDa及融合蛋白CFP10-ESAT6用于结核病血清学诊断的评价[J]. 余琴,林楠,张爱洁,徐伟,刘英杰,万康林. 中国病原生物学杂志. 2017(05)
[6]结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白EspB结构和功能分析[J]. 唐晓萌,王大成. 生物化学与生物物理进展. 2017(05)
[7]结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定[J]. 孙毅凡,李海成,周杰,钱明,陈涛,江勇,赖赛麟,江振友,钟球,周琳. 中国防痨杂志. 2012(08)
博士论文
[1]十六个结核分枝杆菌新抗原的抗原表位鉴定与评价[D]. 王雪枝.中国疾病预防控制中心 2017
硕士论文
[1]结核分枝杆菌模拟表位的筛选及其在结核病血清学诊断中的初步应用[D]. 王丽.南华大学 2017
[2]结核分枝杆菌分泌蛋白的预测研究[D]. 杨欢.电子科技大学 2017
[3]结核分枝杆菌人新B细胞表位及10种特异蛋白的抗原性研究[D]. 徐永娟.南华大学 2016
本文编号：3636891
【文章来源】：宁夏医科大学学报. 2019,41(06)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
淘选噬菌体滴度图
与预期大小为780bp的Rv0674结果相符，见图1。2.2Rv0674的纯化纯化的Rv0674蛋白经SDS-PAGE鉴定，获得了大量的高纯度的可溶性蛋白质，其分子量略大于25kDa，与Rv0674预测的分子量26.5kDa一致，见图2。2.3Rv0674特异性结合肽筛选2.3.1滴度测定以Rv0674为靶分子，每轮筛选后对收集到的噬菌体进行滴度测定，见图3。2.3.24轮筛选结果以Rv0674为靶分子，使噬菌体表面展示的随机多肽与之结合，经4轮“吸附-淘洗-洗脱-扩增”后，第3轮得到的是第2轮的36.4倍，第4轮是第3轮的4倍；提示噬菌体得到明显富集，见表1。2.4筛选结果从第4轮产物中随机挑取40个噬菌体单克隆进行核苷酸序列测定，结果表明2、3、4、5、10、13、17、19、20、21、22、25、26、27、28、29、32、35、36号共19个噬菌体所携带的核苷酸序列和翻译出的多肽氨基序列相同，分别为ACCTCCACCAT－GATGATGCATATGAATCTT和TSTMMMHMNL，该类多肽实现了富集。同时也筛选到了其他9种多肽，提示这些多肽可能对Rv0674蛋白的亲和力和特异性比较好，见表2。3讨论TB是由MTB引起的危害全球人类健康的重大传染性疾病之一，目前在用于临床TB诊断的几种方法中，虽然细菌学诊断一直是TB诊断的金标准[9]，但耗时长，假阳性率高[10]。而血清学诊断简单、快速、高效、低廉，成为近几年来研究的热点[11]，但单一的抗原检测往往不能同时满足高灵敏性和特异性的要求[12]。研究[13]发现，通过MTB分泌蛋白抗原T细胞表位展示的外源性多肽分子，将其应用于TB的血清学诊断，能够满足快速、灵敏的诊断要求。感染MTB的病人，在出现临床症状前几个月甚至几年就存在MTB分泌抗原的抗体。因此MTB分泌性蛋白的相关研究引起了越来越多的人关注，对多种分泌性蛋白如ESAT-6[14]
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达结核分枝杆菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究[J]. 刘晶,张赞,刘洋,杨桂连,姜延龙,王春凤. 中国免疫学杂志. 2019(01)
[2]结核分枝杆菌分泌蛋白调控巨噬细胞自噬诱导持续性感染[J]. 张彩勤,杨丽,张廷芬,师长宏. 科学技术与工程. 2018(32)
[3]噬菌体展示技术在药物研发中的应用[J]. 侯雪莹,胡卓伟,崔冰. 药学学报. 2018(08)
[4]结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备[J]. 李国涛,臧珂. 应用预防医学. 2017(04)
[5]Rv2031c、38kDa及融合蛋白CFP10-ESAT6用于结核病血清学诊断的评价[J]. 余琴,林楠,张爱洁,徐伟,刘英杰,万康林. 中国病原生物学杂志. 2017(05)
[6]结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白EspB结构和功能分析[J]. 唐晓萌,王大成. 生物化学与生物物理进展. 2017(05)
[7]结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定[J]. 孙毅凡,李海成,周杰,钱明,陈涛,江勇,赖赛麟,江振友,钟球,周琳. 中国防痨杂志. 2012(08)
博士论文
[1]十六个结核分枝杆菌新抗原的抗原表位鉴定与评价[D]. 王雪枝.中国疾病预防控制中心 2017
硕士论文
[1]结核分枝杆菌模拟表位的筛选及其在结核病血清学诊断中的初步应用[D]. 王丽.南华大学 2017
[2]结核分枝杆菌分泌蛋白的预测研究[D]. 杨欢.电子科技大学 2017
[3]结核分枝杆菌人新B细胞表位及10种特异蛋白的抗原性研究[D]. 徐永娟.南华大学 2016
本文编号：3636891
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/binglixuelunwen/3636891.html
最近更新
教材专著
