GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

发布时间：2022-07-19 15:06

　　目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd（a）抗原的表达。结论:CR... 

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9载体构建
        1.2.2 胚胎成纤维细胞的制备以及单细胞克隆的获得与鉴定
        1.2.3 GGTA1/β4GalNT2双基因敲除WZSP的制备与鉴定
        1.2.4 GGTA1和β4GalNT2抗原表达鉴定
    1.3 统计学方法
2 结果
    2.1 CRISPR/Cas9敲除位点选择和打靶载体构建
    2.2 GGTA1和β4GalNT2双基因敲除克隆的获得与鉴定
    2.3 GGTA1-/-β4GalNT2-/-WZSP的制备与鉴定
    2.4 WZSP克隆猪体内αGal和Sd (a) 抗原表达鉴定
3 讨论
    3.1 近交系五指山双基因敲除猪首次克隆成功, 具有较大的应用优势
    3.2 CRISPR/Cas9一次性编辑2个基因


【参考文献】：
期刊论文
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[3]人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立[J]. 曾华沙,姚俊,王红顺,王盈,杨海元,曹新,戴一凡.  南京医科大学学报(自然科学版). 2018(02)
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[6]神经细胞异种移植的研究进展[J]. 张青,周翠冰,戴一凡,蔡志明,牟丽莎.  器官移植. 2017(04)
[7]CRISPR/Cas9系统介导的一步法胚胎注射获得猪GGTA1敲除胚胎[J]. 尹智,袁雪薇,吕嘉伟,王加强,刘忠华,牟彦双.  畜牧与兽医. 2016(04)
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本文编号：3663640