卵泡液微环境对人羊水干细胞体外分化为雌性生殖细胞的影响

发布时间：2022-10-11 16:32

　　目的观察不同直径猪卵泡内卵泡液诱导人羊水干细胞（human amniotic fluid stem cells,hAFSCs）-070607株向雌性生殖细胞分化的效果。探讨卵泡内微环境对体外雌性生殖细胞形成的影响。方法选取不同直径猪卵泡内的卵泡液（S组:直径＜3 mm、M组:直径3～6 mm、L组:直径＞6 mm）,检测卵泡液内雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）的含量及骨形态发生蛋白15（BMP15）的表达。将不同分组卵泡液添加到雌性生殖细胞分化体系中,经过5 d的体外诱导培养,观察生殖细胞基因OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和甲基化基因DNMT3B的表达变化。继续用M组卵泡液诱导hAFSCs-070607,观察基因及蛋白表达的变化。结果通过基因、蛋白和三胚层分化的检测,确定hAFSCs-070607具有良好的多能性及分化潜能。3组不同直径的卵泡液内都含有FSH,但不含E2;BMP15的未成熟蛋白在M组中的含量略高于S、L组。M组添加到诱导分化培养基后,E2的产量较高,生殖相关标记基因检测结果发现,OCT4、FIGLα、GDF9、FSHR和DNMT3B基因的表达依次按照大、中... 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料与试剂
    1.2 分组
    1.3 hAFSCs-070607细胞株的鉴定
        1.3.1 PCR检测hAFSCs-070607株的相关基因表达
        1.3.2 细胞免疫荧光技术检测hAFSCs-070607株的相关蛋白表达
        1.3.3 hAFSCs-070607株三胚层分化实验
    1.4 不同直径卵泡内卵泡液对hAFSCs诱导效果检测
        1.4.1 猪卵泡液的收集
        1.4.2 检测不同直径卵泡中卵泡液的卵母细胞自分泌蛋白BMP15的表达情况
        1.4.3 化学发光法检测培养基中激素含量
        1.4.4 实时荧光定量PCR检测卵泡液诱导后hAFSCs的相关基因表达
    1.5 M组卵泡液诱导hAFSCs过程中基因及蛋白表达的变化
        1.5.1 实时荧光定量PCR检测卵泡液诱导后hAFSCs的相关基因表达
        1.5.2 荧光显微镜观察pBMP15-EGFP转染的卵泡液诱导后hAFSCs
        1.5.3 细胞免疫荧光技术检测hAFSCs-070607株的相关蛋白表达
        1.5.4 Western blot检测
    1.6 统计学方法
2 结果
    2.1 hAFSCs-070607细胞株的鉴定
        2.1.1 PCR检测hAFSCs-070607株的相关基因表达
        2.1.2 细胞免疫荧光技术检测hAFSCs-070607株的相关蛋白表达
        2.1.3 h AFSCs-070607株三胚层分化实验
    2.2 不同直径卵泡内卵泡液对hAFSCs诱导效果检测
        2.2.1 猪卵泡液的收集
        2.2.2 不同直径卵泡中卵泡液的卵母细胞自分泌蛋白BMP15的表达情况
        2.2.3 化学发光法检测培养基中激素含量
        2.2.4 实时荧光定量PCR检测卵泡液诱导后hAFSCs的相关基因表达
    2.3 M组卵泡液诱导h AFSCs过程中基因及蛋白表达的变化
        2.3.1 实时荧光定量PCR检测卵泡液诱导后hAFSCs的相关基因表达
        2.3.2 荧光显微镜观察pBMP15-EGFP转染的卵泡液诱导后hAFSCs
        2.3.3 细胞免疫荧光技术检测hAFSCs-070607株的相关蛋白表达
        2.3.4 Western blot检测
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]人卵母细胞样细胞体内分化模型的建立[J]. 俞晓丽,王宁,马洋洋,万千惠,秦明鸣,王华岩.  生物工程学报. 2015(03)



本文编号：3690908