TAT蛋白转导结构域跨膜递送机理及其应用基础研究

发布时间：2023-03-29 19:53

　　TAT蛋白的转导结构域PTD（残基47-57）能介导外源蛋白跨膜递送进入细胞，然而迄今为止，有关TAT-PTD的跨膜递送机制仍然不清楚。因此，构筑并应用模型蛋白，探讨TAT-PTD跨膜递送的机理及其应用，对充分发挥TAT-PTD在临床治疗中的作用具有重要意义。 为构筑模型蛋白，本研究先通过PCR扩增目的基因TAT-GFP，把鉴定正确的目的基因TAT-GFP与质粒pGEX-2T连接，构建了带有GST标记的pGEX-TAT-GFP质粒。将其转化大肠杆菌BL21后，再把在大肠杆菌BL21大量表达的GST-TAT-GFP通过GS-4B亲和色谱纯化，得到了分子量约为54.3kD的融合蛋白GST-TAT-GFP。 在此基础上，本文用荧光显微镜和荧光分光光度计来检测纯化后呈活性状态的融合蛋白GST-TAT-GFP在不同条件下与体外培养的细胞作用，以探讨TAT-PTD的跨膜递送机理。实验结果表明：①GST-TAT-GFP能有效跨膜递送进入多种细胞,不仅能进入细胞质，而且可以定位到细胞核周围。②其递送动力学特性如下：对时间和浓度有依赖关系，15min内就可以跨膜递送进入Hela细胞，随着浓度的增加进入...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
第一章 综述
    1.1 TAT-PTD的研究概况
        1.1.1 背景介绍
        1.1.2 TAT-PTD的发现
        1.1.3 TAT-PTD的跨膜递送机制的研究
        1.1.4 TAT-PTD的应用
            1.1.4.1 小分子的递送
            1.1.4.2 肽的递送
            1.1.4.3 蛋白的递送
            1.1.4.4 反义递送
            1.1.4.5 体内递送
            1.1.4.6 颗粒递送
        1.1.5 TAT-PTD的应用前景
    1.2 绿色荧光蛋白(green fluorescent ptotein，GFP)
        1.2.1 GFP的来源、结构和性质
        1.2.2 GFP与其它传统标记物的比较
        1.2.3 GFP标记的检测方法
        1.2.4 GFP的应用
    1.3 本研究课题的来源、研究目的和主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验流程
    2.2 实验试剂和材料
        2.2.1 质粒、菌株、细胞株和动物
        2.2.2 主要药品和试剂
        2.2.3 色谱材料
        2.2.4 培养基
        2.2.5 常用溶液及缓冲液
        2.2.6 主要使用仪器
    2.3 重组质粒GST-TAT-GFP的构建
        2.3.1 目的基因TAT-GFP的扩增
            2.3.1.1 引物的设计与合成
            2.3.1.2 引物溶解
            2.3.1.3 PCR扩增体系
            2.3.1.4 目的基因片断TAT-GFP的回收与纯化
        2.3.2 pUCm-TAT-GFP质粒载体的构建
            2.3.2.1 目的基因片断TAT-GFP与pUCm-T Vector的连接
            2.3.2.2 pUCm-TAT-GFP质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
                2.3.2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
                2.3.2.2.2 转化
            2.3.2.3 含pUCm-TAT-GFP质粒阳性克隆的筛选
            2.3.2.4 pUCm-TAT-GFP质粒的酶切
            2.3.2.5 酶切后目的基因片断TAT-GFP的回收和纯化
            2.3.2.6 PCR鉴定
        2.3.3 pGEX-TAT-GFP的质粒载体的构建
            2.3.3.1 目的基因TAT-GFP与质粒pGEX-2T连接
            2.3.3.2 转化和重组子的筛选
                2.3.3.2.1 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备
                2.3.3.2.2 转化
                2.3.3.2.3 重组子的鉴定
    2.4 融合蛋白的表达、纯化及鉴定
        2.4.1 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
            2.4.1.1 原理
            2.4.1.2 溶液的配制
            2.4.1.3 实验步骤
        2.4.2 融合蛋白GST-TAT-GFP与GST-GFP的表达对照
        2.4.3 GST-TAT-GFP融合蛋白高表达克隆的筛选
        2.4.4 融合蛋白GST-TAT-GFP与GST-GFP表达条件的选择
            2.4.4.1 诱导温度的选择
            2.4.4.2 诱导时间的选择
        2.4.5 融合蛋白的大量表达、纯化及SDS-PAGE分析
            2.4.5.1 融合蛋白GST-TAT-GFP与GST-GFP纯化的原理
            2.4.5.2 实验步骤
        2.4.6 融合蛋白的定量(Folin酚法)
            2.4.6.1 试剂
            2.4.6.2 标准曲线的绘制
            2.4.6.3 样品测定
        2.4.7 融合蛋白的Western blotting鉴定
            2.4.7.1 材料与试剂
            2.4.7.2 实验步骤
        2.4.8 融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP的荧光学特性研究
        2.4.9 两种重组菌上清液、清洗液与菌体裂解液成分的比较
    2.5 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送作用的研究
        2.5.1 细胞培养、样品处理、实验结果观察与测定
            2.5.1.1 细胞和细胞培养
            2.5.1.2 样品处理
            2.5.1.3 实验结果观察与测定方法
                2.5.1.3.1 荧光显微镜观察
                2.5.1.3.2 荧光分光光度计定量
        2.5.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送机制的研究
            2.5.2.1 细胞种类对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
                2.5.2.1.1 荧光显微镜观察
                2.5.2.1.2 荧光分光光度计定量
            2.5.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的动力学研究
                2.5.2.2.1 时间的影响
                2.5.2.2.2 浓度的影响
                2.5.2.2.3 温度对融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
                    2.5.2.2.3.1 荧光显微镜观察
                    2.5.2.2.3.2 荧光分光光度计定量
            2.5.2.3 细胞代谢作用对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
            2.5.2.4 硫酸乙酰肝素对融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
                2.5.2.4.1 荧光显微镜观察
                2.5.2.4.2 荧光分光光度计定量
        2.5.3 融合蛋白GST-TAT-GFP对细胞的毒性研究
            2.5.3.1 融合蛋白对细胞膜完整性的影响
                2.5.3.1.1 原理
                2.5.3.1.2 试剂
                2.5.3.1.3 标准曲线的绘制
                2.5.3.1.4 实验步骤
            2.5.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送对细胞的毒性测定
                2.5.3.2.1 试剂
                2.5.3.2.2 实验步骤
        2.5.4 GST-TAT-GFP跨膜递送作用在动物体中的应用
            2.5.4.1 腹腔注射
            2.5.4.2 皮肤涂抹
                2.5.4.2.1 实验分组
                2.5.4.2.2 涂抹方法
                2.5.4.2.3 取材与制片
第三章 结果与讨论
    3.1 重组质粒pGEX-TAT-GFP的构建
        3.1.1 目的基因TAT-GFP的扩增
        3.1.2 质粒载体pGEX-2T和目的基因片断TAT-GFP的回收
        3.1.3 含pUCm-TAT-GFP质粒阳性克隆的筛选
        3.1.4 重组质粒pGEX-TAT-GFP的构建
    3.2 GST-TAT-GFP与GST-GFP的表达、纯化及其鉴定
        3.2.1 融合蛋白GST-TAT-GFP与GST-GFP的表达对照
        3.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP高表达克隆的筛选
        3.2.3 融合蛋白GST-TAT-GFP与GST-GFP表达条件的确定
            3.2.3.1 诱导温度的选择
            3.2.3.2 诱导时间的选择
        3.2.4 融合蛋白的大量表达、纯化及SDS-PAGE分析
        3.2.5 融合蛋白的表达量测定
        3.2.6 融合蛋白的Western blotting鉴定
        3.2.7 融合蛋白荧光学特性的研究
        3.2.8 两种重组菌上清液、清洗液与菌体裂解液成分的比较
    3.3 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送作用的研究
        3.3.1 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送机制的研究
            3.3.1.1 细胞种类对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
            3.3.1.2 融合蛋白跨膜GST-TAT-GFP跨膜递送的动力学特性
                3.3.1.2.1 时间对融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
                3.3.1.2.2 浓度对融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
                3.3.1.2.3 温度对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
            3.3.1.3 细胞代谢作用对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
            3.3.1.4 硫酸乙酰肝素对GST-TAT-GFP跨膜递送的影响
        3.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP的毒性研究
            3.3.2.1 融合蛋白GST-TAT-GFP对细胞膜完整性的影响
            3.3.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP对细胞的毒性研究
        3.3.3 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜递送的应用
            3.3.3.1 融合蛋白GST-TAT-GFP在小白鼠体内组织的跨膜递送
            3.3.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP在小白鼠皮肤的跨膜递送
结论
致谢
参考文献
附录:TAT-GFP 测序结果
个人简历、在学期间的研究成果及发表的学术论文



本文编号：3774372