乙肝病毒羧基末端截短的preS2/S编码蛋白（MHBst）对端粒酶逆转录酶启动子反式激活作用的初步研究

发布时间：2023-06-06 19:12

　　目的: 分别构建HBV截短型中蛋白(MHBst)真核表达载体与带有端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和荧光素酶的报告基因质粒,利用体外共转染实验,转入端粒酶表型不同、处于不同分化阶段的多种细胞中,通过检测荧光素酶活性,探讨MHBst对hTERT启动子的调控作用,为揭示HBV相关性疾病的发生机制提供新思路。 方法: 1.乙肝病毒截短型中蛋白在肝癌细胞中的表达及其反式激活作用研究 设计引物,PCR扩增两条长度不同的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经PCR及测序鉴定。将重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度,以验证所构建的HBV截短型中蛋白表达载体在体外的反式激活作用。为进一步研究HBV截短型中蛋白及编码基因片段对肝癌细胞的影响,将重组质粒pcS2和pcTS分别转染肝癌细胞系HepG2,经G418筛选,获得阳性细胞,通过生长曲线与集落形成试验研究MHBst对肝癌细胞的生物学特性的影响。 2.端粒酶逆转录酶启动子报告基因质粒 ...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
英文摘要
符号说明
前言
第一部分 构建具有反式激活作用的HBV截短型中蛋白真核表达载体
    技术路线
    1 材料
        1.1 质粒与菌种
        1.2 细胞
        1.3 主要试剂
        1.4 试剂盒
        1.5 DNA分子量marker
        1.6 PCR引物
        1.7 一般试剂
        1.8 主要实验仪器
    2 方法
        2.1 重组子的构建
            2.1.1 质粒DNA的制备
            2.1.2 目的基因片断的获得
            2.1.3 质粒pcDNA3的酶切线性化与回收
            2.1.4 目的基因片断与载体的连接
            2.1.5 连接产物的转化
            2.1.6 阳性重组子pcS2与pcTS的筛选鉴定
            2.1.7 阳性克隆的保存
        2.2 乙肝病毒截短型中蛋白表达载体反式激活作用的研究
            2.2.1 QIAprep Spin minprep试剂盒抽取与纯化质粒DNA
            2.2.2 HepG2细胞培养
            2.2.3 脂质体转染
            2.2.4 细胞的收集与裂解
            2.2.5 荧光素酶表达量的测定
        2.3 稳定表达的乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌生物学特性的影响
            2.3.1 脂质体介导HBV截短中蛋白表达载体转染肝癌细胞HepG2
            2.3.2 阳性克隆的稳定筛选
            2.3.3 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达
            2.3.4 冻存稳定筛选的阳性克隆细胞
            2.3.5 生长曲线的测定
            2.3.6 软琼脂集落形成实验
    3 结果
        3.1.重组子的构
            3.1.1 质粒的获得
            3.1.2 PCR扩增目的基因片断
            3.1.3 目的基因片断和载体的酶切回收
            3.1.4 阳性重组子鉴定
        3.2.乙肝病毒截短型中蛋白的反式激活作用
            3.2.1 脂质体转染
            3.2.2.乙肝病毒截短型中蛋白对SV40启动子／增强子有反式激活作用
        3.3.乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌细胞生物学特性的影响
            3.3.1 阳性克隆的稳定筛选
            3.3.2 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达
            3.3.3 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的生长
            3.3.4 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的集落形成能力
    4 讨论
第二部分 构建端粒酶逆转录酶启动子报告质粒
    技术路线
    1 材料
        1.1 质粒
        1.2 细胞
        1.3 引物
        1.4 主要试剂
    2 方法
        2.1 重组子pGL3-TRTP的构建
            2.1.1 质粒pCR—TRTP，pGL3-basic的酶切鉴定
            2.1.2 目的片断TRTP的获取
            2.1.3 载体pGL3-basic线性化
            2.1.4 目的片断TRTP与载体pGL3-basic的回收与纯化
            2.1.5 目的基因TRTP与载体的连接
            2.1.6 重组质粒pGL3-TRTP的转化
            2.1.7 阳性克隆株pGL3-TRTP的鉴定
        2.2 重组子pGL3-del445的构建
            2.2.1 目的片断Del445的获取
            2.2.2 质粒pGL3-basic的酶切线性化
            2.2.3 目的基因Del445与载体pGL3-basic的连接
            2.2.4 重组质粒pGL3-del445的转化
            2.2.5 阳性重组子pGL3-del445的筛选鉴定
        2.3 hTERT启动子活性的验证
            2.3.1 原代细胞的培养
            2.3.2 RT-PCR检测不同细胞系hTERT的表达
            2.3.3 hTERT启动子活性的鉴定
    3 结果
        3.1.重组子的构建
            3.1.1 质粒pCR-TRTP、pGL3-basic的鉴定
            3.1.2 目的基因片断的获得
            3.1.3 目的基因片断与载体的酶切回收
            3.1.4 阳性重组子pGL3-TRTP、pGL3-del445的酶切筛选
            3.1.5 DNA测序及序列分析
        3.2.hTERT启动子活性的验证
            3.2.1 原代细胞HELF的培养
            3.2.2.不同细胞hTERT的表达
            3.2.3.hTERT启动子在不同细胞系中的活性
    4 讨论
第三部分 MHBst对hTERT启动子的反式激活作用的研究
    技术路线
    1 材料
    2 方法
        2.1 不同细胞hTERT的扩增
        2.2 共转染实验
        2.3 细胞的收集与荧光素酶表达量的测定
        2.4 反义寡核苷酸封闭MHBst表达的最佳量
            2.4.1 脂质体转染
            2.4.2 抽提RNA
            2.4.3 逆转录扩增实验
            2.4.4 HBV截短中蛋白的PCR扩增
        2.5 反义封闭
        2.6 反义封闭后荧光素酶表达量的测定
    3 结果
        3.1 不同细胞hTERT的表达
        3.2 HBV截短中蛋白对hTERT启动子的反式激活作用
            3.2.1 共转染验证其反式激活作用
            3.2.2 最佳反义寡核苷酸浓度
            3.2.3 特异性反式激活作用的验证
    4 讨论
小结
拟进展计划
参考文献
附图
    第一部分附图
    第二部分附图
    第三部分附图
附录 质粒物理图谱
致谢
发表论文及论著目录



本文编号：3832045