结核分枝杆菌EF4敲除菌株的构建

发布时间：2023-10-04 05:27

　　EF4是一个由lepA基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道。为探索EF4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌lepA基因敲除株。本研究以结核分枝杆菌H37Ra全基因组DNA为模板,设计并通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增lepA基因左、右臂,连接到p0004S质粒,构建同源重组质粒p0004S-ΔlepA。然后,通过噬菌体体外包装,将p0004S-ΔlepA质粒连接到phAE159质粒,构建phAE159-ΔlepA噬菌体包装质粒。在耻垢分枝杆菌mc²155中大量扩增噬菌体并受结核分枝杆菌侵染进行同源重组,筛选阳性克隆,从基因组和蛋白质表达水平检测该突变株中lepA基因及EF4蛋白表达。PCR结果显示,敲除株基因组中lepA基因已被潮霉素抗性基因成功替换,蛋白免疫印迹结果显示该敲除株中无EF4表达,表明其为成功构建的RaΔlepA。生长曲线分析显示,正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长趋势一致。敲除株与野生株...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和质粒
        1.1.2 试剂和培养基
    1.2 方法
        1.2.1 p0004S-ΔlepA质粒的构建
        1.2.2 phAE159-ΔlepA穿梭质粒的构建
        1.2.3 噬菌体扩增
        1.2.4 lepA基因敲除菌株的构建
        1.2.5 lepA基因敲除菌株的验证
        1.2.6 菌落形态及生长曲线
        1.2.7 细菌生物膜
        1.2.8 胁迫实验
2 结果
    2.1 p0004S-ΔlepA质粒的构建
    2.2 phAE159-ΔlepA穿梭质粒的构建
    2.3 噬菌体扩增
    2.4 lepA基因敲除菌株的构建
    2.5 野生株和敲除株的菌落形态及生长曲线分析
    2.6 野生株和敲除株生物膜形成能力的分析
    2.7 野生株和敲除株耐胁迫能力的分析
3 讨论



本文编号：3851409