Notch信号通路在BMP2诱导iMEF细胞成骨分化中的作用及机制研究

发布时间：2017-06-19 20:08

  本文关键词：Notch信号通路在BMP2诱导iMEF细胞成骨分化中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨形态形成蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)具有很强的诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨能力,且已应用于临床骨科疾病的治疗,但临床应用效果不如早期实验室研究,因此有必要对其成骨机制做进一步深入的研究。目前许多研究表明Notch信号在成骨分化中发挥着必不可缺少的作用。那么Notch信号能促进BMP2成骨吗?其可能机制如何?本研究拟在确定Notch信号对BMP2介导MSCs成骨中的作用及阐明其可能的机制,以期在改进BMP2临床治疗效果上提供潜在的解决方案。第一部分:目的:了解Notch信号通路在BMP2诱导的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)成骨分化中的作用。方法:利用γ-内分泌酶抑制剂(DAPT)、显性负性突变型Notch1腺病毒(Ad-dn Notch1)和过表达DLL1腺病毒(Ad-DLL1),分别下调和上调Notch信号,采用细胞化学染色及活性测定检测成骨早期指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积,通过qRT-PCR检测成骨基因的水平。结果:明显抑制了BMP2介导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标钙盐的沉积,且呈剂量依赖性(与对照组相比);与BMP+RFP组相比,dnNotch1能够抑制BMP2介导的成骨早期指标ALP的活性,抑制晚期成骨指标钙盐的沉积及成骨相关基因的表达。而dll1显著促进bmp2诱导imef细胞早期成骨指标alp的活性,晚期成骨指标钙盐的沉积及成骨相关基因的表达(p0.05)。结论:notch有重要的促进bmp2诱导间充质干成骨分化的作用。第二部分:目的:探讨notch促进bmp2诱导的imef细胞成骨分化中的分子机制。方法:利用γ-内分泌酶抑制剂(dapt)、显性负性突变型notch1腺病毒(ad-dnnotch1)和过表达dll1腺病毒(ad-dll1),分别下调和上调notch信号,首先采用q-pcr检测了dapt、dll1、dnnotch1对bmp2信号通路Ⅰ、Ⅱ型受体mrna表达水平的影响,其次采用westernblot和荧光素酶检测其对经典bmp2信号通路中smad1/5/8磷酸化水平和smad结合元件(smad-bindingelement,sbe)转录活性影响。最后,结晶紫染色测定细胞增殖的变化,流式细胞术分析周期及凋亡的影响。结果:与对照组相比,dapt作用下alk1、alk6、actrⅡ和actrⅡβmrna的表达没有变化,而alk2、alk3、bmprⅡmrna的表达有不同程度下降,且alk2的下降与dapt成剂量依赖性;而dnnotch1作用下只有alk2的表达下调,其他受体的表达没有明显变化;在dll1作用下,bmp2信号通路中Ⅰ、Ⅱ型受体alk2、alk3、bmprⅡ均表达上调。其次,免疫印迹(westernblot)和荧光素酶(sbe)实验显示,dnnotch1明显下调p-smad1/5/8水平及sbe转录活性,而对smad1/5/8总蛋白量没有明显改变;而dll1明显上调smad1/5/8的磷酸化水平及sbe的转录活性,对总smad1/5/8蛋白量没有明显改变。结晶紫染色和流式细胞术(fcm)分析结果显示,dnNotch1抑制BMP2介导的细胞增殖作用,使G2+S期的细胞数明显减少(与对照组比);而DLL1则能显著增加细胞的增殖作用,导致G2+S期的细胞数比对照组显著增多;而细胞凋亡没有变化(p0.05)。结论:Notch信号显著促进BM2介导的成骨分化,可能是通过影响BMP2相应受体的表达、经典BMP-Smad信号通路的激活及细胞的早期增殖来实现其促成骨作用的。
【关键词】：Notch信号通路 BMP2 MSCs 成骨分化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 技术路线12-13
• 前言13-17
• 参考文献14-17
• 第一部分 Notch信号通路在BMP2诱导的iMEF细胞成骨分化中的作用研究17-34
• 1 材料与方法17-23
• 2 结果23-29
• 3 讨论29-32
• 参考文献32-34
• 第二部分 Notch信号通路促进BMP2诱导iMEF细胞成骨作用机制研究34-48
• 1 材料与方法34-39
• 2 结果39-45
• 3 讨论45-47
• 参考文献47-48
• 全文总结48-49
• 文献综述49-59
• 参考文献56-59
• 致谢59-60
• 硕士在读期间发表论文题录60

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 鲁茁壮,王立生,吴祖泽;Notch信号通路研究进展[J];生理科学进展;2004年02期

2 周庆军,胡若真,邵健忠,项黎新;Notch信号转导与调控[J];生物化学与生物物理进展;2004年03期

3 艾建平,李永青,吴秀山;Notch信号途径与心血管发育[J];生命科学研究;2004年S1期

4 刘佳;陈怀增;谢幸;;哺乳动物神经发育过程中的Notch-Hes信号途径[J];医学综述;2007年08期

5 葛常辉;;糖基化对Notch信号传递系统的影响[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年12期

6 宋顺成,张玉诚,冯德振;THE APPLICATION OF BOUNDARY ELEMENT METHOD IN STRESS ANALYSIS OF AUTOFRETTED TUBE WITH NOTCH[J];Applied Mathematics and Mechanics(English Edition);1990年02期

7 王兆强;顾临怡;冀宏;陈家旺;李林;;Flow field simulation and establishment for mathematical models of flow area of spool valve with sloping U-shape notch machined by different methods[J];Journal of Central South University;2014年01期

8 李荣,张茹;Notch信号途径的调节[J];生命科学;2003年05期

9 孙丽光,孙祖s，

本文编号：463590