纤毛运送蛋白IFT25与IFT27基因分析及体内外互作研究

发布时间：2017-06-20 11:18

  本文关键词：纤毛运送蛋白IFT25与IFT27基因分析及体内外互作研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：纤毛内运送(IFT)是纤毛内运送颗粒在纤毛基部和其顶端之间进行的双向运动。IFT颗粒由复合物A和B组成,分别至少含有8个和12个IFT蛋白分子。最新研究表明,纤毛是一种细胞天线,负责胞外信息向胞内的传递,而IFT颗粒是纤毛生物生成和纤毛信号分子在纤毛和胞内进行传递所必需的。目前已知纤毛物理缺失或其功能缺陷会导致糖尿病和肥胖等多种营养代谢疾病的发生,这一类病因此又被统称为“纤毛病”。然而,目前的现状是人们对调控纤毛内运送的分子机制知之甚少。IFT25和IFT27是IFT-B复合物的小磷酸化蛋白和小G蛋白组分,由ift25和ift27编码。本研究通过对莱茵衣藻中IFT25及IFT27氨基酸序列进行生物信息学分析,我们得知二者在不同物种中高度保守。纤毛运送蛋白IFT25为亲水性蛋白,IFT27为疏水性蛋白,二者皆无跨膜结构和信号肽,属于非分泌型胞内蛋白。在体外相互作用的研究中,以pGEX-2T, pMAL-C2H为表达载体,将目的基因ift25和ift27分别与上述两种载体相连构成重组质粒,然后导入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达。通过Western blotting检测得到IFT25与IFT27在体外表达的关系。由实验结果可知,IFT25单独表达时为可溶性蛋白,IFT27单独表达时为水不溶性蛋白,而IFT25与IFT27共表达成的融合蛋白为水溶性蛋白。在体内相互作用研究中,采用基因沉默的方法,分别使IFT25或IFT27在细胞纤毛内的表达量降低,以FLA10为内参,Western blotting法检测目标蛋白的表达量,探究其中一个表达量降低时,对另一蛋白表达量的影响。RNA水平分析发现,以野生型CC-125的表达量为对照,ift25基因沉默后,ift25基因的表达量降低而ift27表达量却增高；然而ift27基因沉默后,ift27表达量降低而ift25不变。蛋白水平分析发现,IFT25蛋白水平降低时IFT27蛋白含量也随之下降,而当IFT27蛋白水平降低时IFT25含量不变。由之前的报道可知IFT27的缺陷会引起纤毛病,而本研究告诉我们IFT25与IFT27无论在体内还是体外都存在相互作用,因此我们推测IFT25与IFT27协同作用于纤毛的装配,并深刻影响其生理功能。
【关键词】：莱茵衣藻 纤毛 IFT25 IFT27 基因分析 体内外互作
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-20
• 1.1 莱茵衣藻8-10
• 1.1.1. 莱茵衣藻的结构8
• 1.1.2 莱茵衣藻生活史8-9
• 1.1.3 莱茵衣藻作为实验载体的优势9-10
• 1.2 纤毛10-12
• 1.2.1 纤毛的结构10
• 1.2.2 纤毛的分类10-11
• 1.2.3 纤毛的功能11-12
• 1.2.4 纤毛病12
• 1.3 纤毛运送蛋白(IFT)12-15
• 1.3.1 IFT的发现12
• 1.3.2 IFT的组成12-13
• 1.3.3 IFT的运动机制13-15
• 1.4 RNA干扰15-17
• 1.4.1 RNA干扰载体构建的方法16
• 1.4.2 RNA干扰载体构建的特征16-17
• 1.5 莱茵衣藻核转化17-18
• 1.5.1 基因枪法17
• 1.5.2 玻璃珠法17
• 1.5.3 电击法17-18
• 1.6 本实验的研究意义及研究内容18-20
• 1.6.1 研究的背景和意义18-19
• 1.6.2 主要内容19-20
• 2 材料与方法20-42
• 2.1 实验材料20-28
• 2.1.1 藻种,菌种,质粒及引物20-21
• 2.1.2 主要药品21-23
• 2.1.3 仪器与设备23-24
• 2.1.4 培养基24-25
• 2.1.5 标准溶液的配制25-28
• 2.2 实验方法28-42
• 2.2.1 生物信息学在线分析及软件应用28-29
• 2.2.2 体外相互作用29-36
• 2.2.3 体内相互作用36-42
• 3 结果与讨论42-61
• 3.1 莱茵衣藻基因ift25与ift27生物信息学分析42-49
• 3.1.1 蛋白序列同源性分析42-43
• 3.1.2 蛋白理化性质与结构分析43-49
• 3.2 IFT25与IFT27体外相互作用研究49-55
• 3.2.1 大肠杆菌表达载体pGEX-2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的构建49-50
• 3.2.2 重组质粒pGEX2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的双切验证50-51
• 3.2.3 转化菌株载体导入验证51
• 3.2.4 IFT25和IFT27在蛋白水平的相互作用51-55
• 3.3 IFT25与IFT27体内相互作用研究55-61
• 3.3.1 莱茵衣藻人工干扰载体的构建(以pChlamyRNA3int-IFT25为例)55
• 3.3.2 pChlamyRNA3int-IF25及pChlamyRNA3int-IFT27的测序验证55-56
• 3.3.3 莱茵衣藻生长曲线测定56-57
• 3.3.4 莱茵衣藻核转化57
• 3.3.5 抗性藻种的筛选57-58
• 3.3.6 IFT25与IFT27在转录水平的关系58-59
• 3.3.7 IFT25与IFT27在蛋白水平的关系59-61
• 4 结论61-62
• 4.1 莱茵衣藻IFT25与IFT27蛋白序列分析61
• 4.2 体外相互作用61
• 4.3 体内相互作用61-62
• 5 展望62-63
• 6 参考文献63-68
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况68-69
• 8 致谢69-70
• 附录70

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